マウスモデルにおける腸由来微生物代謝産物の頭蓋内注射

要約

出典: Liou, C. et al.自由に動くマウスにおける腸由来微生物代謝産物の脳室内送達J. Vis. 経験。(2022)。

このビデオでは、自由に動くマウスに短鎖脂肪酸(SCFA)を頭蓋内注射して、脳を介した行動に対する短鎖脂肪酸(SCFA)の影響を研究する方法を紹介します。マウスの脳に埋め込まれたガイドカニューレにインジェクターカニューレを挿入します。回復後、マウスは新しいケージに慣れます。次に、SCFA が投与され、自発運動行動が記録されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 実験動物の準備

1. 6〜8週齢の野生型C57BL/6JNarl雄マウスをベンダーから入手します。
2. マウスを標準的なマウスケージに、標準的なマウスチャウと滅菌水を自由に収容します。
   注:実験動物センターの飼育条件は、温度22±1°C、湿度55%±10%、明暗サイクル13時間/11時間です。

2.定位固定

手術定位固定装置

1. 、手術器具、および関連アイテムを準備して滅菌します。
   注:感染を避けるために、手術部位に直接接触するすべてのアイテムを滅菌する必要があります。
2. マウスを酸素中の1%〜5%イソフルランを含むプレキシガラスケージに入れて麻酔します。
   注:マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1呼吸に維持されていることを確認します。
3. マウスを麻酔室から取り出します。ペットトリマーで手術部位(マウスの頭)を剃ります。定位固定切歯ホルダーの切歯バーにマウス切歯を固定して、マウスを定位固定フレームに置きます。ノーズコーンマスクで鼻を覆います。
4. 定位固定手術中は、酸素中の1%〜2.5%イソフルランでマウスを麻酔します。つま先のつまみ反射を介してマウスの侵害受容を評価し、手術部位を切開する前に一定の呼吸数を確保します。
5. 手術中の体温を維持するために、定位固定フレームのマウスの下に加熱パッド(37.0°C)を置きます。あるいは、プログラムされたウォーマーと加熱パッドを接続する直腸体温プローブを使用して深部体温を維持します。
6. 頭のトリミングした毛皮を粘着テープで取り除きます。痛みを和らげるために、鎮痛剤ケトプロフェン(5mg / kg)をマウスに皮下注射します。ドライアイを避けるために眼軟膏を塗ってください。
7. 尖ったイヤーバーを外耳道に挿入して頭を固定します。
8. イヤーバーの目盛りを調整して、頭を中央に配置します。
垂直方向の
9. 動きを避けるために、切歯ホルダーのノーズクランプを締めます。頭を軽く押して頭が固定されていることを確認し、その後の手術中に頭が緩まないようにします。
10. 綿棒を使用してクロルヘキシジンの3つの交互のスクラブで頭皮を消毒します。各スクラブを中央から外側に向かって(最も消毒された中央領域から最も消毒されていない領域まで)開始します。
    注:中央から外側にスクラブを使用すると、科学者が毛皮からの感染と汚染を最小限に抑えるのに役立ちます。外側は剃っていない頭の部分に近く、まだ毛皮が多く、徹底的な消毒は容易ではありません。
11. 外科用ブレードを使用して頭皮を前後(<1cm)に切開します。切開部を開き、顕微解剖鉗子で保持した綿棒で頭蓋骨を拭きます。
    注:顕微解剖鉗子、手術用ブレード、および綿棒は、手術前にオートクレーブ滅菌によって滅菌する必要があります。手術プロセス中、ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、すべての手術器具を滅菌します。手術中および動物の間に手術用ブレードと鉗子を保持するために、滅菌されたビーカーを準備します。
頭
12. 蓋骨のブレグマとラムダを特定します。ブレグマを基準として使用して、対象領域を特定します。
    1. オプション: 定位ドリルを定位ドリル ホルダーに取り付け、ドリルの先端を使用して Bregma を参照としてポイントします。ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して定位ドリルを少なくとも5秒間滅菌します。
13. Bregma / Lambdaによって、左/右および前/後面の平らな頭蓋骨の水平面を校正して位置合わせします。
    注:正しい水平面にない場合は、マウスを定位固定装置に再度取り付けます。

3.市販のカスタマイズされたガイドカニューレ移植

定位

1. 座標に基づいて右側脳室の位置を特定し、ラベルを付けます:ブレグマまでの距離、前方/後方(A / P):0.26 mm、内側/外側(M / L):-1.0 mm、背側/腹側(D / V):-2.0 mm。
   注:座標は、関心のある領域に基づいて変更できます。側脳室の座標は、体重範囲が26〜30 gの成体C57BL / 6Jマウスに基づいていました。
2. 市販のガイドカニューレを埋め込むための定位固定ドリルを使用して、ラベル付けされた部位の頭蓋骨に穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
3. ステンレス鋼のネジを取り付けるための定位ドリルを使用して、頭蓋骨にさらに2〜4つの穴(直径= 1.5 mm)を開けます。
   注:ガラスビーズ滅菌器(150°C)を使用して、各動物の前後に少なくとも5秒間、定位固定ドリルを滅菌します。
4. 骨の切れ端を拭き取り、綿棒で止血します。
5. 局所麻酔、鎮痒、鎮痛効果を得るために、綿棒を使用してリドカイン(1 mg / kg)で頭蓋骨を拭きます。穴を開けても出血が止まらない場合は、止血のために綿棒を穴にそっと置きます。
6. 穴に2〜4本のステンレスネジを取り付けて、歯科用アクリル用のアンカーを提供します。
7. 市販のガイドカニューレを定位固定カニューレホルダーに置き、ガラスビーズ滅菌器(150°C)で消毒します。
   注:市販のガイドカニューレ、市販のダミー、および市販のインジェクター(図1A)は、材料表に示されている仕様でカスタマイズされました。
8. 定位固定カニューレホルダーを側脳室用に開けられた穴に移動し、市販のガイドカニューレを希望の深さ(2.5 mm)までゆっくりと穴に挿入します。
   注:背側/腹側座標は、先端が穴にかろうじて挿入されているときに、市販のガイドカニューレの先端を基準として設定することで定義できます。
9. 10 μLのn-ブチルシアノアクリレート接着剤(組織粘着接着剤)を塗布して、市販のガイドカニューレをドリル穴に固定し、3〜4分間待ちます。市販のガイドカニューレを定位固定カニューレホルダーからそっと外し、ホルダーを離します。
10. 切開した頭皮に歯科用アクリルを塗布して市販のガイドカニューレを固定し、少なくとも5分間待ちます。市販のダミーを市販のガイドカニューレに埋め込んで、血液や体液によるカニューレの詰まりを防ぎます(図1B)。
11. イヤーバーを外耳道から外し、定位固定フレームからマウスを取り外します。
12. マウスを新しいケージに入れ、その下に加熱パッドを置き、麻酔から回復し、マウスが完全に目覚めるまで観察し続けます。
    注:胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻ってはいけません。
13. 施設動物管理使用委員会(IACUC)のプロトコルと実験計画に応じて、マウスをシングルハウジングまたはグループハウジングに戻します。グループ飼育の場合は、望ましくない怪我やカニューレの剥離を最小限に抑えるために、ケージに収容されるマウスの数を減
らしてください。
14. 術後のケアのためにイブプロフェン(0.2 mg / mL)を飲料水に少なくとも3日間投与し、少なくとも3日間、痛みや苦痛の兆候がないか1日2回監視します。
    1. 術後のケア中は、マウスの炎症や感染を防ぐために、皮膚の周囲にロキシスロマイシン軟膏を塗布します。
    2. 動物の状態を監視し続け、十分なエネルギーを供給するために、5% グルコースおよび/または 0.9% 塩化ナトリウムを適時に腹腔内注射します。
    3. 痛み、苦痛、または感染の状態が着実に悪化する場合は、_CO2吸入によってマウスを安楽死させます。
15. マウスが短鎖脂肪酸(SCFA)の脳室内送達および行動試験の準備が整うまで、手術後1週間待ちます。

4. SCFAの調製酢

1. 酸ナトリウム、酪酸ナトリウム、およびプロピオン酸ナトリウムを人工脳脊髄液(ACSF)に溶解します( 材料表を参照)。
2. 化学物質が完全に溶解していることを確認してから、pHを7.4に調整し、SCFA混合物を0.22μmフィルターでろ過して滅菌します。

5. 行動テスト中に SCFA を脳室内に送達するための注入システムをセットアップ

します

1. 天井カメラを取り付けて、動作を記録します。カメラをコンピューターに接続して、ビデオ録画ソフトウェアを制御します(図2)。
2. 10 μLのシリンジに蒸留水を入れます。
   注:マイクロリットルのシリンジに気泡が入らないようにしてください。
3. マイクロインジェクションポンプとマイクロインジェクションコントローラーを接続します。
4. マイクロインジェクションポンプにマイクロリットルシリンジを取り付けます。シリンジを取り付けるには、ボタンを押してクランプを緩め、シリンジを対応する位置に取り付けます。クランプを閉じ、マイクロインジェクションポンプのプランジャー保持ネジを締めます(図3A)。
5. 市販のインジェクターをポリエチレンチューブに挿入します(図1A)。
6. ポリエチレンチューブをテストアリーナの上の天井カメラに吊るします。
7. インスリン注射器を使用してポリエチレンチューブに蒸留水を入れます。マイクロリットルのシリンジを吊り下げ式ポリエチレンチューブに接続します。
   注: ポリエチレンチューブがテストアリーナ全体でマウスを自由に動けるように十分な長さであることを確認してください。

6. マイクロインジェクションコントローラーのシステム設定

1. マイクロインジェクションコントローラーの電源を入れ、すべてのチャンネルを表示を押してコマンド画面にアクセスします(図3C)。[構成]を押して、[ボリュームターゲット]を9,800 nLに設定し、[デリバリーレート]を100 nL/sに設定します。マイクロリットルシリンジに接続されたポリエチレンチューブから9,800 nLの蒸留水を注入します(方向を押して注入モードに切り替え、RUNを押します)(図3Cのコマンド画面の赤い四角形を参照)。
2. [構成]を押して、[ボリュームターゲット]を3,000 nLに設定し、[デリバリーレート]を100 nL / sに設定します。3,000 nLの鉱物油を抽出します([方向]を押して[抽出]モードに切り替え、[実行]を押します)(図3Cのコマンド画面の赤い四角形を参照)。
   注:ポリエチレンチューブで明確な油水相分離を観察する必要があります。
3. マイクロリットルのシリンジ針からポリエチレンチューブを分解します。マイクロリットルのシリンジニードルから3,000 nLの蒸留水を吐き出します(方向を押して注入モードに切り替え、実行を押します)。
4. マイクロリットルのシリンジをポリエチレンチューブに挿入します。[Configuration]を押して、[Volume Target]を9,500 nLに設定し、Delivery Rateを100 nL/sに設定します。9,500 nL の SCFA を撤回します ([方向] を押して [撤回] モードに切り替え、 [実行] を押します)。オイル-SCFA相にラベルを付けて、SCFAが正常に注入されているかどうかを検証します。
5. [Configuration](設定)を押して、デリバリーレート(Delivery Rate)で目的のボリュームターゲットを7 nL/sに設定します。[Direction]を押して、注入モードに切り替えます(図3Cの[コマンド]画面の赤い四角を参照してください)。
   メモ:注入時間に基づいて容量を決定します。たとえば、送達速度が 7 nL/s の場合、注入時間が 3 分の場合、目標量 = 1,260 nL です。
6. RUNを押して、市販のインジェクターのフロントエンドで液体が出てくるまでマイクロリットルシリンジを前方に注入してから、インジェクターをカニューレに挿入してSCFAを注入します。

7.自由に動くマウスの市販のガイドカニューレを介して側脳室へのSCFAの注入マウス

を酸素

1. 中の1%〜5%イソフルランでプレキシガラスケージに入れることにより、マウスを麻酔します。
   注:マウスを注意深く観察して、呼吸数が毎秒約1呼吸に維持されていることを確認します。
2. マウスを首筋に押し、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレに挿入します(図3B)。
   注:市販のガイドカニューレが血液または体液で詰まっている場合は、ピンセットでそっと詰まりを取り除きます。
3. 行動試験の前に、マウスをケージ内で15分間麻酔から回復させます。
4. 基本的な移動テストでは、マウスを新しいケージに入れ、35分間自由に探索させます。最初の5分間で2,100 nLの目標体積に対して7 nL / sの送達速度を使用してSCFAを注入します(注入モードへの方向を押してRUNを押します)。
   注:新しいケージ内の移動は、動物行動ビデオ追跡ソフトウェアを使用して分析できます。
5. マウスを麻酔し(ステップ7.1を繰り返し)、市販のインジェクターを市販のガイドカニューレから取り外します。
   注:マウスは、前の注射を洗い流すために適切な時間を与えた後、異なるコントロール/代謝物を繰り返し注射することができます。カニューレがマウスの頭に固定されている限り、マウスはさまざまな代謝産物で繰り返しテストできます。

8. マイクロインジェクションシステムの復元

マイクロ

1. リットルのシリンジからポリエチレンチューブを分解します。
2. インスリン注射器を使用してチューブに空気を注入し、ポリエチレンチューブ内の蒸留水を廃棄します。マイクロリットルの注射器を空
にします。
3. [Configuration](設定)画面の[Reset Pos]を押して、[Syringe Stop Figure Definition](シリンジストップ図定義)画面を開きます(図3C)。
4. ビープ音が鳴るまで[引き抜き]を押して、マイクロインジェクションポンプを完全に引き抜いた位置にリセットします(図3C)。
5. コマンド画面に戻り、この画面に**END REACHED**記号がある場合はマイクロインジェクションコントローラの電源を切ります(図3C)。

結果

図1:マウスへの市販のガイドカニューレの移植。(A)市販のガイドカニューレ、ダミー、インジェクターの代表的な画像。(B)歯科用アクリルで固定してマウスの脳に埋め込まれた市販のガイドカニューレとダミーの代表像。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料
Advil Liqui-gels 可溶化イブプロフェン A2:D41	ファイザー	n/a
ボトルトップ真空フィルター、500 mL、0.22 μm、PES、滅菌	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF: 0.14 g/L
クロルヘキシジン スクラブ 2%	Phoenix	NDC 57319-611-09
クロルヘキシジン溶液	Phoenix	NDC 57319-599-09
市販のダミー	RWD ライフ サイエンス	62004	Single_OD 0.20 mm/M3.5/G = 0.5 mm
販のガイド カニューレ	RWD ライフサイエンス	62104	Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm
商用インジェクター	RWD ライフサイエンス	62204	Single_OD 0.21 mm-33G/ M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-グルコース	シグマ アルドリッチ	G8270	ACSF: 0.61 g/L
歯科用アクリル	HYGENIC	n/a
固定ネジ	RWD ライフ サイエンス	62521
馬血清	ThermoFisher Scientific	16050130
インスリン注射器	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
イソフルラン	パニオン & BF バイオテック	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF: 0.19 g/L
ケトプロフェン スイス	薬	n/a
リドカイン	アストラゼネカ	n/a
低融点 アガロー	ス Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF: 0.19 g/L
顕微鏡スライド	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
鉱物油ライト、白色 NF	Macron ファインケミカル	MA-6358-04
NaCl	シグマ アルドリッチ	S9888	ACSF: 7.46 g/L
NaH₂PO₄	シグマ アルドリッチ	S8282	ACSF: 0.18 g/L
NaHCO₃	シグマ アルドリッチ	S5761	ACSF: 1.76 g/L
n-ブチルシアノアクリレート接着剤 (組織接着剤)	3M	1469SB	3M Vetbond
ニューラルトレーサー	サンタクルーズ	SC-358883	フルオロゴールド
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148
ポリエチレン管	RWD ライフサイエンス	62329	外径 1.50、内径 0.50 mm および外径 1.09、内径 0.38 mm
プラルーブ獣医 (眼) 軟膏	デクラ	12920060
酢酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S2889	SCFA: 13.5 mM
アジ化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S2002
酪酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	B5887	SCFA: 8 mM
プロピオン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	P1880	SCFA: 5.18 mM
ステンレスガイドカニューレ	Chun Ta ステンレススチールエンタープライズ株式会社	該当なし	外径 0.63 mm;地元ベンダー
ステンレスインジェクターChun	Taステンレス鋼企業株式会社	該当なし	外径 0.3 mm; ダミーはインジェクターから作られています。地元のベンダー
スーパーグルー	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
機器
カニューレホルダー	RWD ライフサイエン	B485-68217
シーリングカメラ	FOSCAM	R2
デジタル定位固定装置	Stoelting	51730D
解剖顕微鏡	INNOVIEW	SEM-HT/TW
ガラスビーズ滅菌器	RWD ライフサイエンス	RS1501
加熱パッド	Stoelting	53800M
マイクロ解剖鉗子	ROBOZ	RS-5136	鋸歯状のわずかな曲線。非常にデリケート。0.5mmの先端幅;4インチ長さ
解剖はさみ	ROBOZ	RS-5918	4.5インチアングルシャープ
マイクロインジェクションコントローラー	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch コントローラー
インジェクションシリンジポンプ	World Precision Instruments (WPI)UMP3T-1		UltraMicroPump3
リットルシリンジ	Hamilton	80014	10 μL
ダブルファイバーステップ付き光ファイバーコールドライト		LGY-150	ローカルベンダー
ペットトリマー	WAHL	09962-2018
ソフトウェア
動物行動ビデオ追跡ソフトウェア	Noldus	EthoVision	バージョン: 15.0.1416

市製ス マイクロマイクロマイクロ