脊髄損傷後の軸索再生のためのシュワン細胞播種導管

要約

出典: Lee, Y., et.al.切断されたラット脊髄断端を橋渡しし、ギャップを越えた軸索再生を促進するために、PVDF-TrFE導管内のシュワン細胞の移植。J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオは、切断されたラット脊髄の軸索再生を促進するために、シュワン細胞を播種した圧電ポリマー導管の使用を示しています。導管は構造的なガイダンスを提供し、その生体電気特性は神経突起の成長を刺激します。導管内のシュワン細胞は神経栄養因子を分泌し、吻側断端と尾側断端の間の軸索架橋をサポートします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.T8<

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T7からT9の周りにリトラクターを配置します。すべての椎板を取り除いたら、特にT8で横突起間の隙間が見えることを確認します。また、T7からT9までの両側の長さに沿って骨を調べて、外側に突き出た骨片がないことを確認します。
注:T8のこのギャップは、完全な切断を実行するために重要です。コンジットの挿入を容易にするために、長さに沿った椎骨を取り除く必要があります。

角度の付いたバネハサミを使用して、T8の上下の背側と腹側の根を切ります。脊髄に生理食塩水を加え、血液が凝固するのを待ちます。
注:このステップは、適切な導管挿入のために重要です。

T8の横突起の隙間に、脊髄の上の角度の付いたバネハサミを置き、脊髄を完全に切断するために1つの切り込みを入れます。得られた2〜2.5 mmの隙間に圧縮フォームの小片を置き、すぐにその領域に生理食塩水を追加します。

2. 導管の挿入

1. 切断された臍帯の断端が止血に達するのを待っている間に、1x PBS から導管を取り出します。吸収三角形を細く長い断片に切り、導管に入れて余分なPBSを除去します。事前にカットされたウィンドウが開いていることを確認します。
吸収
2. 三角形の細長い部分を使用して生理食塩水と血液を除去します。マイクロスパチュラを使用して脊髄の2つの断端を持ち上げ、良好な分離を確保します。マイクロスパチュラで吻側の切り株をそっと持ち上げ、窓を自分の方に向けた状態で導管を切り株の上に滑り込ませます。切り株全体が挿入され、導管に過剰な出血がないことを確認します。
3. 尾側の切り株をそっと持ち上げ、導管のもう一方の端を切り株の上に滑り込ませます。切り株全体が挿入され、窓が背側にあることを確認してください(図1A)。

3. シュワン細胞(SC)/注射用マトリックスの調製と注射

切断

1. された臍帯が止血に達するのを待っている間に、GFP-SC ペレットの上の培地を取り除きます。GFP-SCを10 μlの冷たいDMEM / F12に再懸濁します。10 μlの冷注入ゲルを細胞懸濁液に加え、ピペッティングを繰り返してよく混合します。GFP-SC/DMEM/F12/注射可能なマトリックス混合物を、コンジットの挿入が完了するまで氷上に置いてください。
2. 背側表面の窓が開いていることを確認した後(図1A)、ウェスタンブロットローディングチップとマイクロピペットを使用して、事前にカットされた窓の1つから20μlのGFP-SC / DMEM / F12 /注射可能なマトリックス混合物を導管に注入します。SC/DMEM/F12/注射可能なマトリックス混合物が導管を過剰に充填する必要がある場合は、吸収三角形で余分なものを取り除きます。注射後は窓を閉めます。縫合は必要ありません(図1B)。

結果

図1:SC/DMEM/F12/マトリックスインジェクション後のウィンドウの終了。吻側と尾側の断端の間に導管を配置した後、各フラップを折り返すことで窓を開きます (A)。注入後、窓は閉じられます(B)。スケールバー= 1 mm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12	ThermoFisher Scientific	11039-021	"DMEM/F12" in protocol.
メスフィッシャーラット(160-180g)	Envigo
Vannasはさみ、ストレート	FST	15018-10
スパチュラ	FST	10089-11	ブランドを選択できます。
鈍い端の湾曲したはさみ	FST	14017-18	ブランドを選択できます。
鈍い鉗子	FST	11006-12	ブランドを選択できます。
ロンジュール	FST	16121-14	任意のブランドを選択できます。
角度付きスプリングハサミ	FST	15006-09	ブランドを選択できます。
吸収三角形	FST	18105-03	ブランドを選択できます。
ゲルフォーム	ヘンリー・シャイン	9083300	プロトコルの「圧縮フォーム」。
#10 ブレード	Sklar	06-3010	任意のブランドを選択できます。
Matrigel	Corning	354234	プロトコルにおける「注射可能なマトリックス」。

マイクロ任意の任意の 任意の任意の 任意の