マウス脳組織における有髄ニューロンを可視化するためのコヒーレント反ストークスラマン分光法

要約

出典: McCullagh, E. A., et al.脳スライスにおける髄鞘形成のイメージングのためのコヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)の応用J. Vis. 経験。 (2022年)

このビデオでは、げっ歯類の脳組織のニューロン構造を視覚化するための蛍光およびコヒーレント反ストークスラマン分光法(CARS)イメージングを示しています。Nissl 染色はリボソーム RNA に結合して細胞体を標識しますが、CARS イメージングはレーザー誘発シグナルを介して脂質が豊富なミエリンを標的とします。蛍光画像とCARS画像を重ね合わせると、細胞体と有髄軸索の詳細なビューが得られます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1.

1. 抗体培地(AB培地:0.1 Mリン酸緩衝液(PB:50 mM KH2PO4、150 mM Na2HPO4)、150 mM NaCl、3 mM Triton-X、1%ウシ血清アルブミン(BSA))を標準実験室用シェーカーで室温で30分間、細胞体を可視化するためのNisslの染色フリーフローティング切片を染色します。
   1. アルミホイルやカバーを使用して切片を光から保護します。550 nm以下の波長はCARSイメージングと互換性があります(図1).
      注:Triton-Xまたは他の試薬が脂質のCARSイメージングに影響を与えるとは想定されていませんが、特定の抗体培地による追加のコントロールが必要になる場合があります。
2. 一時停止ポイント:イメージングまで、自由浮遊切片を(光から保護しながら)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に保存します。切片化したら、2週間以内に脳切片を画像化します。

2. イメージング

注: CARS レーザーのセットアップには、80 MHz クロックを提供するファイバー レーザーと、CARS 信号の収集に必要なストークス ビームを 1031 nm に固定した 770-990 nm の調整可能な範囲を持つ OPO (光パラメトリック発振器) レーザーが含まれています。両方のビームに1つの開口部があります。

1. サンプルを顕微鏡に持っていく前に、CARSレーザーをオンにして少なくとも1時間ウォームアップし、CARSレーザーを位置合わせし、ケーラーにコンデンサー光学系と顕微鏡の絞りを位置合わせして、前方CARSイメージングを行います。注:このステップは、CARS顕微鏡が適切に機能するために重要です。
   1. 2 つのレーザー ビーム (ポンプとストーク) の空間アライメントを行うには、CARS レーザー GUI (グラフィカル ユーザー インターフェイス) を介して 2 つの内部 PSD (位置感応検出器) にアクセスします。
   2. CARSレーザーGUIの遅延機能を使用して時間的アライメントを実現し、波長が異なるために分散が異なる2つのレーザー(ポンプとストーク)のパルスを重ね合わせることができます。したがって、ポンプビームとストークスビームの時間的および空間的オーバーラップは、GUIを介したユーザー入力で行われます。
   3. 外部潜望鏡(セットアップの最後の2つのミラー)を調整して、空間的に重なり合った2つのレーザーを顕微鏡のスキャンヘッドミラーの中央に配置します。
   4. 最適なフォワードCARS非デスキャン検出を行うには、コンデンサーがケーラー式であることを確認してください(つまり、コンデンサーがダイヤフラムの中央に配置され、均一な照明を実現する)
に焦点を合わせています
2. 免疫蛍光共焦点イメージングおよびCARSイメージングでは、蛍光イメージング用の可視レーザーを備えた共焦点顕微鏡を組み込むことにより、CARSレーザーをフォワードおよびエピCARS非デスキャン検出器(NDD)の両方に適合させます(図2)。
3. カバーガラス(倒立顕微鏡用)、組織の乾燥を防ぐためのPBS、および組織をカバーガラスに近づけるためのガラスの重りを備えた培養皿に切片を置きます。
4. 60倍、1.2の開口数(NA)赤外補正水対物レンズを使用して、台形体の内側核(MNTB)などの脳領域をイメージングするために、エピ方向にCARS信号を収集し、前方方向に0.55NAコンデンサーを介して収集する役割を果たします。
   1. CARS レーザー GUI を使用して、約 600 mW のポンプ/プローブと 300 mW のストークスで CARS 画像を取得します。これらのレーザー出力値は、システムによって内部で測定されます。サンプル位置でのレーザーの出力は25mW未満で、組織サンプルにとって安全です。
   2. ポンプとストークスビームを空間的および時間的に重ね合わせます。OPOを797.2nmに調整します。これにより、650 nmのCARS波長が得られます。エネルギー準位が高いため、結果として生じる基底状態への復帰は、励起に対する反ストークス(青シフト)です。
   3. バンドパスフィルター(640-680 nm)を使用して、エピまたはフォワード非デスキャン検出器でCARSシグナルをキャプチャし、続いて免疫蛍光標識(この場合は蛍光標識Nissl)を逐次検出します。手記： Nissl ニューロン体細胞マーカーは CARS 640-680 nm バンドパス フィルターに捕捉されないため、以下の画像では蛍光と CARS イメージングの組み合わせが可能です。
   4. CARSと蛍光はPMTを共有しません。これらの設定を使用して最適な脂質シグナルを生成し、脳領域の髄鞘形成を選択的に画像化します。注意：レーザービームからユーザーを保護する
画像
5. を.oibファイルとして保存し、画像解析プログラムにインポートしてさらに定量化できます(図3)。

結果

図1:CARSイメージングは免疫蛍光イメージングと組み合わせることができます。グラフは、CARSイメージングが660/640nmの赤色信号スペクトルで発生することを示しています。この波長は緑、青、またはUVの範囲から十分に離れているため、これらの範囲でCARSシグナルと免疫蛍光の組み合わせが可能です。具体的には、このグラフは、この出版物の代表的な結果の収集中にCARSと組み合わせた青色蛍光色素でタグ付けされたNisslの興奮と発光も示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
染色:
AB培地:			1n 1,000 mLのミリポアH2O
リン酸緩衝液(PB):
リン酸カリウムモノベース	シグマ	P5655
リン酸ナトリウム 二塩基性	シグマ	S7907
BSA (ウシ血清アルブミン)	シグマ ライフ サイエンス	A2153-100g
塩化ナトリウム	フィッシャー ケミカル	S271-1
トリトン X-100	シグマ - アルドリッチ	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS:
APE ピコエメラルドレーザー	Angewandte Physik & Elektronik GmbH
バンドパスフィルター (420-520 nm)	クロマテクノロジー	HQ470/100m-2P
バンドパスフィルター (500-530 nm)	クロマテクノロジー	HQ515/30m-2P
バンドパスフィルター (640-680 nm)	クロマテクノロジー	HQ660/40m-2P
共焦点顕微鏡	オリンパス	FV1000
カットトランスファーピペット	フィッシャー	13-711-7M
ダイクロイックロングパス 565 nm	クロマテクノロジー	565dcxr
ダイクロイックロングパス 585 nm	クロマテクノロジー	585dcxr
ダイクロイックショートパス750nm	マテクノロジーT750spxrxt
ガラス底培養皿	MatTek	P35G-0-10-C
ガラス重量(10 mm x 10 mmボロロッド)	Allen Scientific Glass Inc
光子ショートパス発光フィルター680 nm	マテクノロジーET680sp-2p8
PBS

クロ多クロ