ゼブラフィッシュ幼生の側線有毛細胞におけるカルシウム動態のイメージング

要約

出典: Lukasz, D., et al.ゼブラフィッシュ幼生における側線有毛細胞のin vivoカルシウムイメージングJ. Vis. 経験。(2018年)

このビデオは、共焦点顕微鏡を使用して、麻痺したトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫の側線有毛細胞におけるカルシウム流入のライブイメージングを示しています。流体パルスによる毛束の機械的刺激は、機械伝達チャネルと電位依存性チャネルを通るカルシウムの侵入を誘導し、蛍光指示薬を使用してリアルタイムで視覚化されます。この方法は、ニューマスト有毛細胞の頂端および基底カルシウムの動態を強調し、水の移動検出におけるそれらの役割を解明します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 幼虫をイメージングチャンバーに固定して固定します
   幼
   1. 虫を、幼虫が動かなくなるか触覚に反応しなくなるまで、0.04%MS-222を含む約1 mLの胚バッファー(E3)バッファーにイメージングチャンバーのシリコン封止材表面に1〜2分間浸します。
      1. 実体顕微鏡下で、幼虫を灌流室の中央に配置し、シリコーン封止材に対して横向きに平らになるようにします。
         注:一貫性を保つために、幼虫は常に同じ側(たとえば、右側を下にして、左側を上にして)取り付けます(図2B1)。
   2. 細い鉗子を使用して、幼虫とチャンバーに垂直に0.035 mmのヘッドピンを下ろします。ヘッドピンを眼と耳小胞の間、および封止材に挿入します(図1B1および1B2)。2番目の鉗子セットを使用して、ピン留め中に幼虫の背側または腹側に沿って幼虫を安定させます。ピンの水平部分が幼虫に接触し、封止材に完全に押し込まれないようにしてください。ピンを腹側に傾けるか(図1B1)、魚の前方に少し向けて、その後の心臓注射や有毛細胞イメージングの妨げにならないようにします。
      1. 鉗子を使用して、0.025 mmの尾ピンを尾の端にできるだけ近い脊索に挿入します(図1B1)。
         注:幼虫が伸びないように注意してください。幼虫を平らに固定します。目を重ね合わせる必要があります(図2B1)。これは、心臓注射の容易さ(図1B2-B2'、ステップ3)、望ましいイメージング面の促進(図1B1-B2''、ステップ5)、および流体ジェット刺激の強度の定量化(図3A3、ステップ4)にとって非常に重要です。
2. 幼虫を麻痺させるための心腔へのα-ブンガロトキシンの注射

注:αブンガロトキシンを取り扱うときは手袋を着用してください。

1. 心臓注射針の目詰まりを防ぐために、使用前にα-bungarotoxinアリコートを短時間遠心分離してください.
   1. ゲルローディングピペットチップを使用して、3 μLのα-ブンガロトキシン溶液を心臓注射針に戻します。溶液を気泡なしで先端に均等にロードします。
   2. 手動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに心臓注射針を挿入します。実体顕微鏡下で、針が固定され麻酔された幼虫のAP軸に対して垂直に、~30°の角度で下を向くように針を配置します。
   3. ピペットホルダーを圧力インジェクターに接続します。次の推奨設定を適用します:P注入 = 100 hPa、t注入 = 0.5秒、およびP補償 = 5 hPa。溶液にボーラスを注入して、針先が特許であるかどうかをテストします。
   4. 針の先端を残すために、赤い溶液(フェノールレッドから)の小さなパフを探します。赤い色が見られない場合は、針の先端をピンの端にそっとこすりつけ、針が開存するまでもう一度試してください。または、先端の開口部が大きい針を引っ張ります。
2. 心臓の外側の皮膚に触れるまで、針を心臓に向かって進めます(図1B2)。針を幼虫に押し込み、心臓の前の皮膚の色素細胞のくぼみを探して、針が幼虫に対して正しい平面に配置されていることを確認します(図1B2')。
   1. 針が皮膚を突き刺して心腔に入るまで、針をさらに進めます。針を少し引き戻します。α-ブンガロトキシンのボーラスを心腔に注射します。心腔の膨張や、空腔に入る赤い染料を探します。
3. 幼虫を1 mLのニューロンバッファー(NB)で3回優しくすすぎ、残留MS-222を除去します。液体をすべて取り除かないでください。灌流室で幼虫を約1 mLのNBに維持します。
   注:ピニングと心臓注射後、およびイメージング実験全体を通して、幼虫の心拍と血流が堅牢に保たれていることを確認してください。
4. 顕微鏡と流体ジェットのセットアップの準備
   1. 材料表に記載されているコンポーネントを使用して正立共焦点顕微鏡を組み立てます:488 nmレーザーと適切なフィルターを備えた共焦点顕微鏡、イメージングと刺激を制御および調整するための顕微鏡ソフトウェア、10倍の空気対物レンズ、60倍の水の対物レンズ、ピエゾZ対物レンズスキャナー(Zスタック用)、高速カメラ、円形チャンバーアダプター、電動ステージ、ステージインサートアダプター。
   2. 真空および圧力ポンプ、高速圧力クランプ、ヘッドステージ(材料表にも記載)の3つの主要コンポーネントで構成される流体ジェットを組み立てます。高速圧力クランプを使用して、ヘッドステージから流体ジェットピペットへの圧力または真空排出のタイミングと持続時間を制御します。
      1. ヘッドステージの出力を、厚肉のシリコンチューブを介して流体ジェットピペットホルダーに接続します。
5. 幼虫と流体ジェットのアライメント

注:各ニューロマスト内には3つの関心面があります:(1)毛束の先端(図3A3:刺激強度の測定に使用されるキノシリア)。(2)毛束メカノトランスダクション(MET)面(図2B1-B1':METチャネル依存性カルシウムシグナルが検出される頂端毛束の基部)。(3)シナプス面(図2B2-B2':有毛細胞の基部でシナプス前カルシウムシグナルが検出される場所)。これらの平面を図2Aに示します。

1. ゲルローディングチップを使用して、適切に壊れた流体ジェットニードルに10 μLのNBを埋め戻します。溶液を気泡なしで先端に均等にロードします。電動マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーに針を挿入します。
2. 灌流チャンバーを顕微鏡ステージの円形チャンバーアダプターに入れます。手記：一貫性を保つために、幼虫を常に同じ方向に配置します(たとえば、幼虫を含むチャンバーは、後方を流体ジェットに向け、腹側を実験者の方に向けます)。
   1. 幼虫が視野の中央になるように電動ステージを移動します。幼虫の前後(A-P)軸が流体ジェット針の軌道とほぼ揃うように、円形チャンバーアダプターを回します。
   2. 透過光と微分干渉コントラスト(DIC)を使用して、幼虫に焦点を合わせ、10倍対物レンズの下に中央に合わせます。目標を10倍上げる。
3. 電動マイクロマニピュレーターを使用して、流体ジェット針を視野の中心に下ろし、透過光に照らされ、NB溶液にほとんど触れないようにします。
   1. 10倍の目標を下げます。幼虫に焦点を合わせて、その位置を確認します。フォーカスして流体ジェット針を見つけます。マイクロマニピュレーターでx軸とy軸で流体ジェット針を、魚の背側と平行な位置になるまで動かします。
   2. 幼虫に焦点を合わせます。針をZ軸に下げます。針を魚の背側に沿って、体から~1 mm離して配置します(図3A1)。
   3. 円形チャンバーアダプターを慎重に動かして(必要な場合)、流体ジェット針が幼虫のAP正中線に沿って位置合わせされていることを確認します(図3A1)。
   4. 電動ステージを動かして、対象のニューロマストを視野の中心に配置します。流体ジェット針の先端を魚の背側に沿って保ちます。流体ジェット針の先端を幼虫やチャンバー表面に触れないでください。
4. 60倍の水の目標に切り替えます。対物レンズがNB溶液に浸されていることを確認します。透過光とDIC光学系を使用してニューロマストの位置を特定するには、ファインフォーカスを使用します。
   注:このセットアップは、一次後側線に沿ってニューロマストを刺激するように設計されています。これらのニューロマスト内の有毛細胞は、前方または後方の流体の流れに反応します。
   マイクロ
   1. マニピュレーターで流体ジェット針を、ニューロマストの外縁から100μmになるように配置します(図3A2)。
      注:横向きのビュー(図2C1-C2)ではなく、明確なトップダウンビュー(図2B1'-B2'および図3A3)を提供するニューロマストを選択してください).明確なトップダウンビューにより、単一の光学平面ですべての頂端毛束を同時にイメージングしたり、より少ない光学平面でシナプス領域をイメージングしたりできます(図3A3)。
   2. 頂端毛束(キノシリア)の先端まで焦点を合わせます(図1A、図3A2および3A3)。流体ジェット針の底は、この平面で焦点が合っている必要があります。
5. 高速圧力クランプを手動モードから外部モードに設定し、イメージングソフトウェアからの入力を受け取ります。
   1. 「ゼロ」ボタンを押して、高速圧力クランプをゼロにします。セットポイントノブを使用して、安静時圧力をわずかに正(~2 mmHg)に設定します。高速圧力clの静止出力を確認しますamp ヘッドステージ出力に取り付けられたポンド/平方インチ(PSI)圧力計を使用して。
      注: 時間の経過とともに流体が流体ジェット針に徐々に取り込まれるのを避けるために、静止時にわずかに正圧を設定します。流体ジェットに接続されたチューブに流体が入り、ヘッドステージに到達すると、機器が損傷する可能性があります。
   2. 毛束を刺激するために必要な圧力を決定します。0.125および0.25V入力(6.25および12.5 mmHg)を200〜500ミリ秒使用して、テスト刺激を適用します(図3A3-A3'')。
      注:高速圧力クランプは、電圧入力(高速圧力クランプコマンドポートのバヨネットニール-コンセルマン(BNC)ポートに接続するソフトウェアまたはその他のデバイスから)をヘッドステージから放電される圧力に変換します。 そして最終的には、流体ジェット針(1.0 V = 50 mmHg、-1.0 V = -50 mmHg)です。この構成(ステップ4.2を参照)では、正圧(プッシュ)は毛束を前方に偏向させ、負圧(引っ張り)は毛束を後方に偏向させます。
   3. 透過光とDIC光学系をスケールバーとともに使用して、毛束の先端であるキノシリアの6.25および12.5 mmHgの刺激によるたわみの距離を測定します(図2Aおよび図3A3-3'')。束を(1つの凝集単位として)約5μmの距離移動させる圧力を選択します(図3A3'')。キノシリアの先端がずっと焦点を合わせたままであることを確認してください。
   4. 幼虫のA-P軸に沿って25μmの流体ジェット±動かして、キノシリアの先端を5μm偏向させる距離と圧力を見つけます。
      注:受精後3〜7日(dpf)の幼虫にGCaMP6を使用すると、5μmのたわみはほぼ飽和したGCaMP6sカルシウムシグナルを達成し、頂端の毛束構造を損傷しないようにする必要があります(図3A3'')。より小さな変位距離を使用して、不飽和刺激を供給できます(図3A3')。変位距離>10μmは推定が難しく(図3A3''')、時間の経過とともに損傷する可能性があります。信号飽和度は、ニューロマストの年齢(および動毛体の高さ)と使用される指標によって異なります。イメージング中は、各方向(圧力/プッシュおよび真空/プル)の流体ジェット針の開存性を定期的にチェックします。流体ジェット針は目詰まりしやすく、真空の開存性を失いますが、残留圧力の開存性は維持されます。DIC光学系と各方向の短いテスト刺激を使用して、流体ジェットの開存性を確認します。
   5. サンプルを目的の平面(例えば、頂端毛束の基部またはシナプス面の有毛細胞の基部)に焦点を合わせます。図2B1-B2')。
6. イメージング取得手順:シングルプレーン取得

注:このプロトコルで概説されているすべてのイメージングは、室温(RT)で実行されます。

1. 100 Hzのフレームレートを達成するために、100ミリ秒ごとにキャプチャしてストリーミングまたは連続80フレームの取得を取得するようにイメージングソフトウェアを設定します。
2. ゲイン、開口部、レーザー出力を設定して信号検出を最適化しますが、飽和、光退色、ノイズは避けます。Opterra/SFCの設定例は次のとおりです。488 nmレーザー出力:50(ヘアバンドルMET面)、75(シナプス面)。35 μmのスリット;ゲイン = 2.7;EMゲイン= 3900.
   注:信号が弱すぎる、ノイズが多すぎる、または過度の光退色がある場合は、2 Xビニングを適用します。2 X ビニングは、空間分解能を犠牲にして信号検出を強化します。
3. フレーム30後の80フレーム(8秒)取得中に、3秒で提供する刺激を選択します。
   注:いくつかの刺激の例は次のとおりです:各有毛細胞の方向感度を同定するために、前方向または後方向に200ミリ秒(+または-0.25V)まで2秒(+または-0.25V)ステップ;2秒、 5Hz方形波(0.25Vで200ms、-0.25Vで200ms、5回繰り返す)で、すべての有毛細胞を同時に刺激します。陽圧(前方刺激)は有毛細胞の半分を活性化します。負圧(後方刺激)は有毛細胞の残りの半分を活性化します。刺激ソフトウェアまたはデバイスが圧力クランプを0Vに戻すことを確認してくださいamp 刺激が終了した後。
4. 機械感受性カルシウム応答を測定します。頂端毛束の基部(図2Aおよび2B1-B1')に焦点を合わせ、画像取得を開始します。
   注:ニューロマストを上から下にはっきりと見た場合(図2B1-B1')、すべての頂端毛束を単一の平面で同時に画像化できます。
5. シナプス前カルシウム応答を測定します。有毛細胞の基部に焦点を合わせ(図2Aおよび2B2-B2')、画像取得を開始します。
   注:ニューロマストを上から下からはっきりと見た場合(図2B2-B2')、すべての有毛細胞のシナプス前イメージング面は、2μm離れた2〜3面で取得できます。Tg[myo6b:ribeye-mcherry]トランスジェニックフィッシュを使用して、シナプス前リボンとカルシウム侵入部位を特定して特定できます。

結果

図1:イメージングチャンバー、ゼブラフィッシュの取り付けと心臓注射の手順、および針。(A)示されているのは、シリコーン封止材の上部の中央に幼虫(破線の長方形で輪郭が描かれている)を備えたイメージングチャンバーです。(B1) 示されているのは、2本のピンで固定された5dpfの幼虫です。大きなヘッドピンは、目のすぐ後ろに体に対して垂直に配置されます。2つの目が完全に重ね合わされているため、下の目は上の目によって完全に隠されています。小さな尾ピンが尾の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
α-Bungarotoxin	R&D Systems	2133	イメージング前に幼虫を麻痺させるための
ングチャンバー	幼虫を取り付けるための	Siskiyou	PC-R
No. 1.5 カバースリップスクエア、22*22 mm	VWR	48366-227	イメージングチャンバーを密閉するため
高真空シリコーングリース	フィッシャーサイエンティフィック	14-635-5D	イメージングチャンバーへのカバーガラスの貼り付け用
シリコーン封止剤クリア 0.5 g キット	エルズワース接着剤	ダウコーニングシルガード、184 SIL ELAST KIT 0.5KG	イメージングチャンバーを充填して魚をピン留めする表面を作成する
体顕微鏡	ルツァイス顕微鏡	透過光照明付き Stemi 2000	、鉗子、はさみを照らしてピンを作る用
細かい鉗子	Fine Science Tools	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) 商品番号 11295-10	ピンを作るための
細かいはさみ	Cole-Palmer	5.5"、EW-10818-00	ピンを作るためのタンステンワイヤーを切断するための
ステンワイヤー、0.035 mm	Goodfellow	W005131	幼虫を固定するためのヘッドピン用
タングステンワイヤー、0.025 mm	ThermoFischer Scientific	AA10405-H4	幼虫を固定するためのテールピン用
フィラメントなしのホウケイ酸ガラス毛細管	Sutter Instrument Company	B 150-86-10	毛細胞を刺激するために流体ジェット針に引っ張られるガラス
ファイン フォー	サイエンス ツール	Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) 商品番号 11295-10	幼虫をピン留め用
ゲルローディングのヒント	エッペンドルフ	5242956003	心臓注射針の埋め戻し用
体顕微鏡	カールツァイス顕微鏡	Stemi 2000 透過光照明付き	ピン留めおよび心臓注射中の幼虫の照明用
ガラスキャピラリー/ニードルホルダー	WPI	MPH315	流体ジェット針を保持するため
手動マイクロマニピュレーター	Narishige	M-152	α-bungarotoxinを注入するためのニードルホルダーの保持と位置決め用
磁気スタンド	Narishige	GJ-1	α-bungarotoxin注入用手動マイクロマニピュレーターを保持用
圧力インジェクター	Eppendorf	Femtojet 4x	α-bungarotoxinを送達するために
	Bruker	Swept field/Opterra 共焦点顕微鏡	DIC光学系と適切なフィルターを備えた488nmレーザーを備えた固定式正立顕微鏡
顕微鏡ソフトウェア	Bruker	Prairieview 5.3	顕微鏡、レーザー、ステージ、ピエゾZ、カメラ、流体ジェットを調整および制御する
10倍のエアオブジェクティブ ニ	コン	MRH00101	幼虫の位置決めと流体ジェットの位置決めのための低倍率
60倍ウォーターオブジェクティブ	ニコン	MRF07620	高NA(1.0)と適切な作動距離(2.0 mm)を備えた水浸対物レンズコントローラー
/ドライバー付きPiezo-Z対物レンズスキャナー	Physik Intruments 機器/Bruker	01144210/UM-Z-PZ	0.025um精度の高速Zスタック取得
EMCCDカメラ	QImaging	Rolera EM-C2 EMCCDカメラ	100フレーム/秒を取得できる小さなピクセルサイズのカメラ
形チャンバーアダプター	Siskiyou	PC-A	顕微鏡ステージ上のイメージングチャンバーの保持と回転用
電動Zデッキステージ	Prior Scientific ZDN12MP		とマイクロマニピュレーターを流体ジェットニードルで保持および移動できる顕微鏡ステージ
Zデッキステージインサートアダプター	NIHマシンショップ	カスタム	形チャンバーアダプターをZデッキステージに取り付けるには
流体ジェット装置	ALA科学機器	HSPC-1 PV-PUMP付き高速圧力クランプ	流体ジェット刺激の制御と供給用
Masterflex過酸化物硬化シリコンチューブ(1フィート)	Cole-Palmer	Masterflex L/S 13, 96400-13	流体ジェットニードルホルダーを圧力ポンプに接続用
電動マイクロマニピュレーター	Sutter Instrument Company	MP-225	流体用ニードルホルダーの保持と位置決め用ジェット
マイクロマニピュレーターコントローラー	Sutter Instrument Company	MPC-200	流体ジェットニードルマニピュレーター制御用
ゲルローディングチップ	Eppendorf	5242956003	ジェットニードルの埋め戻し用
ガラスキャピラリー/ニードルホルダー	WPI	MPH315	流体ジェットニードを保持するため
PSI 圧力計	Sper Scientific	840081	測定用圧力クランプ出力
Prism7	Graphpad	Prism7	GCaMP6強度の変化
FIJI	Schindelin, et., al.34	https://fiji.sc/	画像処理と時空間信号マップ作成ソフトウェア
Turboreg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/	GCaMP6画像シーケンスをFIJIに登録するプラグイン
StackReg Plugin	Thévenaz et., al.29	http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ FIJI Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA
		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html	GCaMP6 強度の変化を測定するための複数の ROI を作成するプラグイン

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