$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 準備
1.2つの細い鋸歯状の鉗子を使用して、幅約1 mmの小さな繊維束で各筋肉をからかいます。
注: からかい中の組織損傷を防ぐために、鉗子で過度の力を持たずに筋肉を非常に優しく操作することが重要です。
1. 前脛骨筋 (TA) の大きさに応じて 3 つまたは 4 つの束に解離します。
2. 腓腹筋(GA)の場合、筋肉の内側部分と外側部分を分離し、サイズに応じて各部分を4〜5束に解離します。
2. 免疫染色
1.筋線維透過処理を進める:筋束をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%(v/v)Triton X-100を含む24ウェルプレートに移し、穏やかな攪拌(50 rpm)下でRTで1時間、または4°Cで5時間保持します。
注:筋肉束を2つのプレートに分割して、別々の免疫染色を進め、抗体混同のリスクを最小限に抑えます。それらを2つ以上のウェル(1ウェル/プレート)に分割しないでください。そうしないと、分析された筋肉における一般的な状態を表す神経筋接合部 (NMJ) の数 (N) が不十分になる可能性があります。
2. サンプルを室温でPBSで5分間3回洗浄し、PBS/Triton X-100 1%中の4%ウシ血清アルブミン(BSA)からなるブロッキング溶液で4°Cで4時間、穏やかに攪拌(50rpm)下でインキュベートします。
注:洗浄ステップでは吸引ポンプを使用せず、200 μLピペットと小型チップを使用して溶液を手動で吸引してください(参照は 材料表に示されています)。
3. ニューロフィラメントM(NF-M、2H3、希釈1/200)またはシナプス小胞糖タンパク質2(SV2、希釈1/200)のいずれかに対する一次モノクローナル抗体を含むステップ2.2で示されたブロッキング溶液を使用して、サンプルを穏やかな攪拌(50 rpm)下で4°Cで一晩(O / N)インキュベートし、それぞれシナプス前軸索終末または活性ゾーンを標識します。
4. 翌日、攪拌(50 rpm)下でPBSで筋肉束を5分間3回
洗浄します。
1. 共焦点イメージングの場合:赤色発光蛍光色素(F594)(希釈1/500)および緑色発光蛍光色素(α-BTX-F488)(希釈1/1000)と結合したα-ブンガロトキシンをPBS中で結合した二次抗マウス抗体とともに筋肉束をインキュベートし、撹拌(50 rpm)下でRTで2時間。
2. 誘導放出枯渇(STED)イメージングの場合:緑色発光蛍光色素(F488)(希釈1/500)およびα-ブンガロトキシンを結合した二次抗マウス抗体と、高い光安定性(α-BTX-F633)(希釈1/1000)を特徴とする遠赤色発光蛍光色素団と結合した-ブンガロトキシンを、撹拌(50 rpm)下でRTで2時間インキュベートします。
注:光退色を避けるために、インキュベーション中にサンプルを光にさらさないでください。
5. 標識された筋肉束を撹拌下(50 rpm)下でPBSで5分間3回洗浄し、封入剤でスライド上に置きます。
注:密閉できるように、スライドごとに最大4〜5個の筋肉束を配置します。
6. 上部にグレード #1.5 (または #1.5H) のガラスカバーガラス (厚さ 0.17 mm) を追加し、スライドの両側に円筒形の磁石を配置して圧力を加え、筋肉を平らにします。
7. スライドを 4°C の光の O/N から保護し、マニキュアで
スライドを永久に密封します。
3. 画像取得
1.共焦点顕微鏡による取得
注:画像は、63倍の振幅の油浸対物レンズ(HCX Plan Apo CS、1.4個開口数(NA))を使用して、倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で収集されました。
1. 盲検分析の場合は、分析に関与していない人に、各スライドに指定された番号をコーディングさせます。すべてのサンプルのNMJパラメータの定量化が完了するまで、実験グループを盲検化したまま
にしてください。
2. microscope softwareをコンフィグレーションモードで>machine.xlhw>起動します。
3. スライドを顕微鏡ステージに置き、DAPIフィルターセットでDAPI広視野蛍光照明下で観察して、サンプル内の観察面を見つけます。
4.[プロジェクトを開く] > [新しいプロジェクト>] をクリックし、画像取得を保存するフォルダーを作成します。
注: フォルダサイズを制限し、コンピュータのメモリの問題を防ぐために、NMJ ごとに新しいプロジェクトを作成します。
5. 取得パラメータを管理するには、[取得]タブウィンドウをクリックし、共焦点ピンホールを1.0エアリー単位とレーザー出力に設定して、画像化する必要があるエンドプレートで488 nmレーザーを使用して、緑色/F488(α-BTX)蛍光のゲインとオフセットレベルを最適化します(ライブモードON)。
6. 次に、F594 観察に適合したレーザーを使用して、赤/F594 (NF-M または SV2) 蛍光取得を最適化します。この研究では、552 nm レーザーを使用しました (ライブモード ON)。各レーザーの色素発光スペクトルを、414〜483 nmのレーザー405(DAPI)、506〜531 nmのレーザー488(F488-α-BTX)、622〜650 nmのレーザー552(NFM/SV2)の範囲で設定します。
7. 各実験群の神経筋接合部の画像スタックを同じ設定で収集します:画像サイズ1024 x 1024ピクセル(73.7 x 73.7 μm)、400 Hzサンプリングレート、双方向Xオン、ズーム係数2.5、Z-WideモードでZステップサイズ0.5 μm。
注:NMJごとに、ジャンクション全体を取得するようにスライスの数が設定されます。上記の取得設定は、ナイキスト・シャノン・サンプリング定理を満たします。ただし、ユーザーは、最近のすべての共焦点オペレーティングソフトウェアにある[フォーマットの最適化]ボタンをクリックして、ピクセルサイズとZステップが理想的なナイキストサンプリングレートを満たしていることを確認できます。このアクションにより、ボリューム測定の精度が低下するオーバーサンプリングまたはアンダーサンプリングされた画像が回避されます。
8. 元のファイル(.lif)またはZスタック画像(.tif)を、スライドのコードネーム、染色タイプ、およびエンドプレート番号を含む名前のフォルダに保存します。
注:488 nmおよび552 nmレーザー(F488およびF594)を使用してスキャンを順次(同時にではなく)収集し、F488蛍光がF594チャネルにクロストークしたり、その逆を回避したりします(ブリードスルー)。ビームパスは、顕微鏡ソフトウェアのDye Assistantで構成できます。
9. 次のコードスライドに変更し、NMJ ごとに手順 3.1.3 から 3.1.8 を繰り返します。
10. セッションの最後に、[3D ビューアで開く] をクリックし、実験グループの代表である NMJ を選択して、3D ラベリングを視覚化します。
注: この表示モードは、取得パラメータが正しいことを確認するのに役立ちます。
11. 顕微鏡ソフトウェアを閉じ、レンズティッシュで対物レンズを洗浄してから、システムの電源を切ります。
2. STED顕微鏡による取得
注:画像は、100倍油浸対物レンズ(HC PL APO CS2 1.4 NA)を使用して、775 nmのゲートSTEDを備えた倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で収集されました。
1. 盲検分析の場合は、分析に関与していない人に、各スライドに指定された番号をコーディングさせます。すべてのサンプルのNMJパラメータの定量化が完了するまで、実験グループを盲検化したまま
にしてください。
2. 顕微鏡ソフトウェアをコンフィグレーションモードで起動します > machine.xlhw と STED ON。
3. [プロジェクトを開く] > [新しいプロジェクトを開く] をクリックして、画像取得を保存するフォルダーを作成します。
>注: フォルダー サイズを制限し、コンピューター メモリの問題を防ぐために、スライドごとに新しいフォルダーを生成します。
4. スライドを顕微鏡ステージに置き、488 nmレーザーを使用して広視野蛍光照明下で観察し、サンプル内の観察面を見つけます。
5. 506-531 nmのスペクトル検出を備えた488 nmレーザーを使用して、ニューロフィラメントM(NFM)またはSV2染色で標識されたNMJを検索します。
6. NMJが識別されたら、[STEDのアクティブ化]をクリックし、640〜750 nmのスペクトル検出を備えた635 nmレーザーを使用して、いくつかの接合部の折り目を含む領域の画像の取得を開始します。
>注:画像取得中は彩度ルックアップテーブルに注意し、露出オーバーを避けるために[クイックLUT]ボタンをクリックします(グレー値>255、8ビットの場合)。
7. 各実験グループの画像を同じ設定で収集します:画像サイズ2048 x 2048ピクセル(38.75 x 38.75 μm)、400 Hzのサンプリングレートで。
注:空乏レーザー(STED)の出力は65%に設定されています。
8. スライドのコードを含むファイル名で画像を保存します。
注: [最適化されたXYフォーマット:フォーマットの設定]をクリックして、STEDイメージングで最適な取得設定を取得することができます。
9. 次のコード化されたスライドに移動し、手順 3.2.3 から 3.2.8 を繰り返します。すべてのスライドに対してこの手順を繰り返します。
10. STED 顕微鏡セッションの最後に、画像ファイルを別のコンピュータに転送し、元のファイル (.lif) を外付けドライブまたはサーバーに保存します。
11. 顕微鏡ソフトウェアの電源を切り、レンズティッシュで対物レンズを洗浄してから、システムの電源を切ります。