動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1.シスターナマグナカニューレ、ヘッドプレート、ヘッドホルダーの準備
手術
- 前にすべての手術器具とヘッドプレートを滅菌します。
注:蛍光トレーサーは、シスターナマグナカニューレ挿入を介してCSFに直接送達されます。 - 簡単に言えば、ニードルドライバーを使用して、30G x 12.7 mm(1/2インチ)の針の先端を3/4下に折り、針の鈍い端をポリエチレン10(PE10)チューブ(長さ約45cm)の一端に入れます。ベベルのみがPE10チューブの境界から突き出ていることを確認します。
- 別の30G針の面取りされた端の1/4を折り、残りの針の鈍い端をPE10チューブのもう一方の端に置き、プラスチック製のルアーロックを取り付けたまま配置します。
- 100 μLのガラスシリンジに滅菌人工CSF(aCSF:126 mM NaCl、2.5 mM KCl、1.25 mM NaH2PO4、2 mM MgSO4、2 mM CaCl2、10 mMグルコース、および26 mM NaHCO3)を充填します。
- シリンジをラインの端に取り付け、面取りされた針の先端に達するまで aCSF で満たします。空気柱は注入量が変化しやすいため、シリンジを空気ではなく aCSF で埋め戻すことが重要です。
- 慢性的な実験の場合は、aCSFで満たされた行を残し、ステップ1.7をスキップします。
- 急性実験の場合は、注射器を輸液ポンプに置き、約5mmの空気を抜くと、混合が防止されます。その後、実験に必要なトレーサーの総量を引き出します(デッドスペースの損失のため、20%の追加をお勧めします)。
注:PE10チューブは、トレーサーを装填するときに気泡がガラスシリンジのプラスチックカフに入らないように十分な長さにする必要があります。典型的な実験では、プロトコルは、aCSFで0.5%に希釈したAlexa Fluor 647(BSA-647)に結合した10 μLのウシ血清アルブミンを使用します。 - ヘッドプレートがヘッドホルダーに収まっていること、および使用するマウスに適したサイズであることを確認してください。これを確実にするための解剖学的マーカーは、窓の上縁が眼間線と揃い、後縁が後頭稜に吻側に落ちます。
注:ステンレス鋼のヘッドプレートは滅菌して再利用できます。ほとんどのシアノアクリレート混合物は、アセトン溶液で除去できます。
2. 外科的処置
- マウスの体重を量り、麻酔します (例: ケタミン/キシラジン、100 mg/kg ケタミン、10 mg/kg キシラジン、腹圧)。
- マウスがつま先をつまんでも反応しなくなったら、首と頭を滅菌水で湿らせ、バリカンを使って剃ります。その部分を剃ったら、その部分をアルコール綿棒でもう一度拭き取り、残った毛を取り除きます。
注:クリッピングする前に毛皮を湿らせると、切開後のイメージングウィンドウの毛の量が大幅に減少します。 - 温度制御されたパッドの上の定位フレームにマウスを置き、マウスの目に石油眼科軟膏を塗布して、マウスが乾燥しないようにします。
- 露出した皮膚をクロルヘキシジン綿棒できれいにします。2分後、アルコールワイプでクロルヘキシジンを取り除きます。最後に、乾かしたままにしておくことができるヨウ素溶液を塗布します。
- 皮下鎮痛剤(0.25%ブピバカインHCl)を頭蓋骨の上部と首に注射します。
- 後頭稜を覆う首の部分から始めて、上にある皮膚に正中線を切り込み、眼窩間線に向かって吻側に続けます。側頭筋が頭蓋骨に挿入される境界を横方向に切開します。紡錘状切開部の皮膚をすべて取り除き、前頭骨と頭頂骨の両方を露出させます。
注意:眼窩後洞は目の尾側にあり、顔面後静脈の大きな枝は耳介の吻側にあります。これらの構造を温存するために切開するときは注意してください。このような場合は、滅菌綿棒で数分間止血を維持して出血を止め、継続してください。 頭- 蓋骨を滅菌生理食塩水で洗浄し、綿棒を使用して表面をきれいにして、破片や髪の毛が画質を妨げるため、表面をきれいにします。頭蓋骨の透明性は、骨膜とその上にある筋膜をそのままにしておくことで最もよく保たれます。
注: これらの構造を誤って取り除くと、時間の経過とともに頭蓋骨が乾燥して不透明になる可能性があります。aCSFで再湿らせるか、パラフィンオイルとグリセロールの混合物を使用して、急性実験で頭蓋骨の反射率を下げます。 - 貯水槽マグナカニューレの挿入に進みます。
- CMカニューレを挿入した後、歯科用セメントとシアノアクリレート接着剤の混合物を境界の周りのヘッドプレートの腹側に塗布し、ヘッドプレートの前縁が鼻骨の後端と一直線に並び、後縁が頭頂間骨の前側に揃うように頭蓋骨に置きます。 矢状縫合糸(正中線)が窓に対して中央にあり、まっすぐであることを確認します(図1B)。
ヘッド- プレートの位置を数滴の接着剤促進剤で固定します。残りの隙間をセメント混合物で埋め、促進剤で硬化させます。
注意: シアノアクリレートがマウスの目に接触したり、イメージングウィンドウを塞いだりしないように注意してください。 - CMカニューレをヘッドプレートに接着して、輸送中やマウスの目覚め時にカニューレが外れないようにします。
- 急性実験の場合は、ステップ2.16に進
みます。- 慢性的な実験の場合は、露出した頭蓋骨に透明乾燥シアノアクリレート接着剤の薄層を塗布し、イメージングを妨げるため気泡が発生しないように注意してください。接着剤は頭蓋骨を保護し、イメージングを妨げません。接着剤が露出した頭蓋骨を切開境界の皮膚まで覆っていることを確認してください。
止- 血クランプを使用して、aCSFで満たされたPE10チューブをCMから2〜3 cm保持し、高温焼灼チップでラインを切断します。分離したら、溶けたPE10チューブを平らにしてカニューレを密閉します。
注意:カニューレが密閉されるまでクランプを放さないようにし、CSF瘻を防ぐためにチューブに漏れがないことを確認してください。 - カルプロフェン(24時間ごとに5 mg / kgを3日間、腹腔内[ip]または皮下[s.c.])を投与し、マウスを温度制御されたシングルハウスケージに戻し、イメージングの少なくとも24時間前に回復させます。マウスが胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください。無傷の頭蓋窓は数週間安定したままです。注:慢性的な実験はここで一時停止できます。
注意:術後の合併症には、頭血腫/ガレ下血腫、CSF瘻、および感染症があります。 - 急性実験の場合は、頭蓋骨が固定位置になるように、ヘッドプレートを使用してマウスをヘッドホルダーに入れます。必ず麻酔レベルを確認し、マウスの下に加熱パッドを置きます。これで、マウスをマクロスコープに持ち込む準備が整いました。
注意: マウスを輸液ポンプと一緒にカートに乗せて慎重に運びます。CM カニューレ挿入が外れると、頭蓋内圧が低下し、CSF の漏れにより実験結果が変化します。
3.イメージングのためのマウスの準備
注
:プロトコルは、イメージング実験が麻酔(ステップ3.1から開始)または覚醒(ステップ3.2から開始)のどちらで実行されるかによって異なります。
- 麻酔マウス
ヘッド- ホルダーをマクロスコープのステージに置き、シリンジポンプからCMカニューレまでのラインによじれがなく、トレーサー注入に影響を与える可能性があるため、ピンと張っていないことを確認します。
- 呼吸数と粘膜のピンク色を観察し、酸素化が良好であることを示します。必要に応じて生理食塩水を皮下注射して水分補給レベルを確保します。動物が十分に麻酔されていることを確認し、必要に応じて再投与します。
- マクロスコープカメラと発光ダイオード(LED)をONにして、LIVEモードを開始します。
矢- 状縫合糸が画像の中央に平行で中央に配置され、フィールドの上部にある鼻前頭縫合糸と下部のラムドイド縫合糸がはっきりと視覚化できるように、画像フィールドの倍率を確認します(図1C)。所定の位置に設置したら、ヘッドホルダーをマクロスコープステージにテープで固定します。
- 露出した頭蓋骨にマクロスコープの焦点を合わせます。マクロスコープは被写界深度が比較的大きいにもかかわらず、マウスの頭蓋骨の曲率により、特定の領域にしか焦点を合わせることができません。焦点面が冠状縫合糸の後方の頭頂骨の外側にある場合に最良の結果が得られます。
注:これは、ほとんどのCSF流入が発生する中大脳動脈(MCA)の位置です(図1D、E)。
- Awake Moce
- イメージングセッションの前に、動物をヘッドプレート手術から少なくとも24時間回復させます。より長い回復期間(5〜7日)もお勧めします。この間、回復期間中、マウスを拘束チューブ内のステージに頭を固定するように訓練します。
注:慣れにより、マウスを麻酔なしでヘッドホルダーに取り付けることができ、実際の実験中のストレスや不安を軽減します。これが実行不可能で、麻酔が実験を妨げない場合は、吸入麻酔薬の導入用量(例えば、1〜2 L/min O2流量で2%のイソフルラン)を使用して、マウスをヘッドステージにすばやく取り付けることができます。 - マウスをヘッドホルダーと拘束チューブに固定したら、手順3.1.1〜3.1.5に従います。
4.蛍光CSFトレーサーの注入
- 急性CMカニューレ挿入
- トレーサーは、ステップ1.6で貯水槽マグナに入れる前にすでにカニューレにロードされているので、輸液ポンプを希望の速度と容量に設定します。日常的に使用される注入パラダイムは、1〜2 μL / minで5〜10 μLですが、これらのパラメータは、特定の実験、または動物のサイズと年齢に応じて調整できます。
- 慢性 CM カニューレ挿入
- イメージング セッションを開始する前に、急性実験のステップ 1.2-1.7 に従って、トレーサーを送達するための輸液ラインを準備します。
- ラインが準備されたら、止血クランプを使用して、慢性CMカニューレの密閉端を切断します。ステップ4.2.1で用意した線から針を取り出し、カニューレにそっと挿入します。クランプを解放し、シリンジポンプを使用して、トレーサーがCMに埋め込まれた針に到達するまで、実験のために所望の注入速度(例:2 μL / min)でCSFトレーサーを進めます。
注意:ラインを接続するときに針がチューブを貫通した場合は、針を取り外し、ピアスされたセグメントを切断して、この手順を繰り返します。PE10チューブに裂けると漏れが発生し、実験結果に影響を与えます。
5. イメージングセッションのセットアップ注入
- される蛍光トレーサーに基づいて、各チャネルの励起波長と露光時間を決定します。タイムラプスイメージングの時間分解能を最大化するために、トレーサーを視覚化するために必要な最短露光時間を選択します。この曝露時間は、異なる動物間の CSF 輸送を比較することを目的とした、その後のすべての実験に使用されます。
注: 1 つのヒントは、CM ラインのトレーサーを使用して曝露時間を調整することです。これは最初のアプローチとして便利ですが、時間の経過とともに最適化する必要があります。 - 実験の期間と画像を取得する間隔を選択します。実験は通常、グリンパ輸送のどの段階が関心があるかに応じて、30〜60分続きます。ほとんどの実験では、1 フレーム/分以上のフレーム レートで十分です。
- ファイル名と保存ディレクトリを設定します。
- 他の変数 (心電図、動脈血圧、電気生理学など) の同時取得に加えて画像が収集される場合は、マクロスコープとポンプをデータ収集ソフトウェアでトリガーするようにプログラムできます。次のステップに進む前に、マクロスコープのトリガー機能が正しいことを確認してください。
6.経頭蓋光学イメージング実験
ト
- レーサー注入とイメージングを同時に開始します。
- CM カニューレと PE10 チューブに漏れの兆候がないか定期的にチェックしてください。CMでトレーサーが漏れている場合は、この実験の結果を除外する必要があります。
注:トレーサーが小脳に蓄積し始め、中大脳動脈(MCA)のグリンパ経路を通過しない場合は、CMカニューレが小脳に注入された可能性があります。このデータは含めないでください。 - 急性期実験の場合は、実験終了後、マウスを顕微鏡から取り外し、十分に麻酔されていることを確認してください。マウスの首を素早く切り落とし、脳組織を採取します。脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで一晩浸漬固定します。
慢性- 実験の場合、イメージングが完了したら、カニューレからCMラインを取り外し、滅菌aCSFで洗い流し、高温焼灼チップでCMカニューレを再密封します。マウスをヘッドスタンドから取り外し、ケージに戻します。それ以上のイメージングが不要になるまでこのプロセスを繰り返し、ステップ6.3に従います。
