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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. げっ歯類の静脈内カテーテル法、ウイルス送達、および光ファイバー移植
- 動物を手術に備える準備をします。
- 施設のガイドラインに基づいて選択した麻酔薬でラットを完全に麻酔します。1 つの選択肢は、塩酸ケタミン (87.5-100 mg/kg、筋肉内 [i.m.]) と塩酸キシラジン (5 mg/kg、i.m.) です。つま先のつまみ反射がないかどうかをチェックして、ラットが完全に麻酔されていることを確認してください。
注意: ケタミンは規制物質であり、施設のガイドラインに従って取り扱う必要があります。
注: この研究では、腹腔内注射よりも迅速かつ信頼性の高い麻酔導入をもたらす麻酔薬の筋肉内注射が使用されます。ラットの呼吸と反応性を継続的に監視し、手術中は温熱サポートを提供します。 - ラットの背中の広い領域(肩甲骨のすぐ上から背中の中央まで)と、右前肢の下の首の領域、および頭皮を剃ります。
- ラットを手術部位に置き、プラルベ(人工涙液)を目に塗布します。体重量のカルプロフェン(鎮痛剤)を背中上部の皮膚から皮下(皮下[s.c.])注射し、次に5 mLの乳酸リンゲル液を皮下注射します。
- 滅菌ガーゼをベタジンで濡らし、円を描くように剃った手術部位を拭き取ることで、すべての手術部位を消毒します。次に、70%エタノールでこのプロセスを繰り返します。この交互サイクルを3回繰り返します。
- 以前に公開されたプロトコルに従って静脈内カテーテル移植を実行します。
注: カテーテル移植中の刺激を避けるために、この手術中は外科用ドレープは使用されません。使用前にすべての器具と機器を滅菌してください。滅菌手袋を使用し、非滅菌表面が接触した場合は手袋を交換してください。 - カテーテル移植の直後に、ラットを定位固定フレームに固定して、アデノ随伴ウイルス(AAV)注射を行います。
- 局所麻酔薬として、2% リドカイン (0.2-0.3 mL) の皮下 (s.c.) 注射を頭皮に投与します。
注: 静脈内カテーテル移植中は、手術結果の変化を避けるために、局所麻酔薬は使用されません。 - 26ゲージのステンレス鋼注射カニューレを、1 μLの濃縮AAV溶液で満たされたハミルトンシリンジに接続します:AAV5-hSyn-tdTomatoまたはAAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
注:oChIEFは、青色光感受性オプシンチャネルロドプシン(ChR2)の変種であり、広範囲の周波数に応答できるため、このプロトコルで説明されている低周波長期うつ病(LTD)実験に有用です。 高周波の長期増強(LTP)実験にも使用されます。oChIEFコンストラクトは、Roger Tsien博士から寄贈され、Duke Viral Vector Coreによって包装および精製のために処理されました。視床(MGN)軸索終末の内側膝状核で最適なウイルス発現を可能にするには、注射日からLTD導入日までの間に少なくとも3〜4週間が必要です。
注意:一般に、AAVはバイオセーフティレベル1(BSL-1)の生物と見なされており、ヘルパーウイルスがその製造に使用されない限り、自己感染のリスクは低くなります。その使用には施設動物管理および使用委員会 (IACUC) の承認が必要であり、不必要な曝露を制限するために、施設のガイドラインに従って適切な個人用保護具 (PPE) を常に使用する必要があります。 - メスを使って頭蓋骨の前から後ろに0.5mmの切開を行い、その上にある組織を取り除いて頭蓋骨の表面を露出させます。
- ラットの頭を前/後軸に水平にし、ブレグマへの定位座標をゼロ
にします。- 小さなドリルビットを備えたドレメルツールを使用して、頭蓋骨に3つの小さな穴を開けます。ドライバーを使用して、ステンレス鋼のネジ(M2x4 965-A2)を所定の位置にしっかりと取り付けます。
注:ネジは、歯科用セメントを適切に結合し、頑丈で長持ちするヘッドキャップを作成するために必要です。スクリューの位置は、頭蓋骨の前後軸を横切って広げ、AAV 注射部位から離す必要があります。 - 内側膝状核(MGN)の内側部分のラット脳アトラス(ワトソンおよびパキシノス)からの座標に基づいて、AAVを注射するための両側穴を開けます。ブレグマからのmm単位、前後(AP):-5.4、中外側(ML):±3.0、背腹腹(DV):-6.6。MGNに配置されるまで、注射カニューレ(4 mm / min)をゆっくりと下げます。濃縮AAV溶液を0.1 μL/分の速度で注入します。
- 注入が完了した後、カニューレを5分間所定の位置に置いて、カニューレから拡散できるようにしてから、カニューレを脳からゆっくりと引き抜きます。
- ウイルス注射直後は、MGN-LA端末を標的とした光ファイバーを移植し続けます。
- Dremel ツールを使用して、外側扁桃体を標的とする光ファイバー インプラント用の両側穴を開けます (ブレグマからの mm、AP: -3.0;ML ±5.1)。
- 鉗子を使用して光ファイバーインプラントのフェルールをつかみ、定位固定アダプターに固定して所定の位置にしっかりと保持します。
- 繊維の先端がLAの背側部分に収まるまで、2 mm / minの速度で繊維をゆっくりと下げます(背腹腹[DV]:-7.9 mm)。
- 最初にロックタイト瞬間接着剤の薄層を使用してフェルールを頭蓋骨に固定し、次に歯科用セメントを固定し、直径1.25mmのフェルールスリーブとダストカバーでフェルールを覆います。
注:フェルールを頭蓋骨に固定するための接着剤の選択は、地域または施設の動物管理および使用委員会によって承認される必要があります。この研究では、複数の接着剤を使用して試行錯誤した後、フェルールを頭蓋骨に確実に固定するためにロックタイトが使用されています。ただし、利用可能な代替手段を検討することはできます。
- 外科的処置の後、ネズミを個別に収容し、餌と水に無料でアクセスできるようにします。施設のガイドラインに準拠した術後ケアを提供します。開存性を維持するために、ゲンタマイシン(5 mg / mL)とヘパリン(30 USP / mL)を含む生理食塩水でカテーテルを毎日洗い流します。手術後少なくとも5日、行動実験開始の24時間前に、食物はラットを自由摂食体重の~90%に制限します。
2. げっ歯類のコカインの自己投与と器具レバーの消滅
注: すべての行動手順は、1 つの壁に 2 つの格納式レバー、各レバーの上に刺激ライト、トーン ジェネレーター、ハウス ライト、および輸液ポンプを備えた標準的なオペラント コンディショニング チャンバーで行われます。
- 固定比率スケジュール 1 (FR1) 強化スケジュールの下で、ラットを毎日 1 時間のコカイン (2 mg/mL) 自己投与トレーニング セッションに被験者にします。
毎日ラ- ットをオペラントチャンバーに入れ、ラットにレバーを押すようにします。指定された「アクティブレバー」(左右のレバーで相殺)を押すと、コカイン注入(1.0 mg / kg /注入)と、複合光とトーンの合図が10秒提示されます。指定された「非アクティブレバー」を押しても、プログラムされた効果はありません。
ラ- ットが連続3日間にわたって少なくとも8回/日の注入を正常に獲得するまで、少なくとも10日間、自己投与実験を継続します。20日目までに取得基準に到達できなかった場合、研究から除外されます。
- 取得基準が正常に満たされた後、ラットを6〜10 d.
ラ- ットをオペラントチャンバーに入れ、ラットが自由にレバーを押すようにします。ただし、アクティブレバーと非アクティブレバーの両方での応答は、プログラムされた結果をもたらしません。
- ラットに、連続2日間で平均<25回のレバープレスが発生するまで、毎日器具による絶滅を続けさせます。
3. LTDのin vivo光遺伝学的誘導
注
:光遺伝学的阻害実験は、機器絶滅の最終日から24時間後に行われます。
カバーを- 取り外した状態で、清潔な標準的なげっ歯類ハウジングケージの上に吊り下げられた回転ジョイントを介して、パッチコードを473nm青色レーザーダイオードに接続します。このセットアップにより、げっ歯類は光遺伝学的刺激中にケージの周りを自由に動き回ることができます。
- 取扱説明書に従ってレーザーダイオードの電源を入れ、パルス発生器に接続します。電源を入れたときに、ラットが900Hzで2ミリ秒の光パルスを1回受け取るように設定を調整します。
注意: レーザーの操作中は、常に適切な目の保護具を使用する必要があります。 - 光センサーを使用してパッチコードを通して光の強度を測定します。パッチケーブルを通る光出力が~5〜7mWになるようにレーザーの強度を調整します。
- ネズミを清潔な飼育ケージに入れます。ダストカバーとフェルールスリーブを取り外し、フェルールを露出させます。パッチコードを光ファイバーインプラントに両側に接続します。LTD導入の前に、ラットに3分間環境を探索させます。
- パルス発生器をオンにして、光遺伝学的刺激を開始します。
注:可能性は低いですが、ラットが刺激に対して何らかの副作用を経験した場合、実験は直ちに終了し、ラットは施設のガイドラインに基づいて適切に安楽死させます。 - LTD導入後、ラットをケージに3分間閉じてから、ホームケージに戻します。
- 対照実験では、AAV5-tdトマト対照ウイルスを発現するラットに同じ刺激手順を使用します。偽実験では、AAV5-oChIEFウイルスを発現するラットの光ファイバーにパッチコードを取り付けますが、15分間のセッション中に刺激は供給されません。
4. 手がかり誘発性コカインシーキングに対する光遺伝学的刺激の効果をテストします
- in vivo 光遺伝学的刺激の 24 時間後、ラットをオペラント コンディショニング チャンバーに戻します。ラットは、コカイン探索行動を評価するために、1時間の標準的な手がかり誘発された回復セッションを受けます。
注:手がかり誘発された回復中、アクティブレバーの応答は、コカイン関連の手がかりの10秒間の提示をもたらしますが、コカイン注入は得られません。 - 光遺伝学的 LTD 誘導がコカイン探索の長期抑制をもたらすかどうかを判断するために、最初の検査から少なくとも 1 週間後に 2 回目の回復テストを実施します