3光子蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ脳の深部組織イメージング

要約

出典:Hontani, Y., et al.無傷マウスとゼブラフィッシュ脳における深部組織三光子蛍光顕微鏡観察J. Vis. 経験。(2022年)

このビデオは、麻酔をかけたゼブラフィッシュの脳における3光子イメージングのセットアップと実行を示しています。このプロトコルにより、蛍光標識ニューロンの深部組織の視覚化が可能になり、神経科学研究アプリケーションのためのリアルタイムのニューロン活動と構造が明らかになります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. ゼブラフィッシュの脳における生体内イメージング
   注:対物レンズの下に魚の脳を適切に配置するために、広視野イメージング用の励起光と同じ経路で二次電荷結合素子(CCD)カメラが使用されます。
   
   1. 顕微鏡をセットアップし、度数を校正します。
   2. 低倍率(通常は4倍)の対物レンズを顕微鏡に置きます。
   3. 魚とチューブが入ったシャーレを顕微鏡下に置きます。
   発
   4. 光ダイオード (LED) 光源を使用してペトリ皿を照らします。
   5. 画像取得ソフトウェアのカメラモードを開きます(図1)。
   6. [ライブ] をクリックします。
   7. 画面右側のチャンネルAを選択します。
   8. ヒストグラムの設定を調整して、画像がはっきりと見えるようにします。
      注: これらは必要に応じて更新する必要があります。
   9. モーターコントローラーのモーター設定をベースに設定します。
   10. 魚が見えるまで対物レンズを下げます。
       注: 対物レンズが頭に物理的に接触しないようにしてください。
   11. 魚の頭の中心を視野の中心に置きます。
   12. 目標を魚の頭から遠ざけて上に移動します。
   13. 3PM(3光子顕微鏡)用の低倍率対物レンズを高開口数(NA)対物レンズに交換します。
       注:低倍率レンズと高NA対物レンズは同焦点である必要はありませんが、魚が高NA対物レンズの視野内にあることを確認するのに十分近い必要があります。
   14. 対物レンズが頭に物理的に接触しないように、対物レンズをゆっくりと下げます。CCDカメラソフトウェアで、頭のてっぺんが見えると対物レンズの動きを止めます。z位置を0μm.
       に設定します注:水浸対物レンズを使用する場合は、対物レンズの下に気泡がないことを確認してください。
   15. LED 光源をオフにし、システムの周囲の暗いカーテンを閉じます。
   16. 3Pイメージング用にイメージング取得ソフトウェアを多光子GGモードに設定し、対物レンズ下のパワーを1mW未満(~1MHzのパルス繰り返し率)に設定します。
   17. モーター コントローラーのモーター設定ボタンを [ベース] から [目標] に変更します。
   18. 部屋の照明を消します。
   19. 光電子増倍管(PMT)の電源を入れ、3PM励起源シャッターを開きます。自家蛍光による蛍光シグナルチャネルと、骨のTHGによる第3高調波発生(THG)シグナルチャネルに骨の輪郭が現れることを確認します(図1C)。
   20. より深くイメージングするときにパワーレベルを上げることにより、さまざまな深さでイメージングを実行します。

結果

図1:魚の生体内イメージングの代表的なスクリーンショット(プロトコルセクション1)。(あ)4倍対物レンズを装着した画像取得ソフトウェアのカメラモードビュー。ソフトウェアの主な機能の概要と番号は次のとおりです。1.画像取得ソフトウェアのイメージングモード。モードオプションは、カメラ、マルチフォトン、マルチフォトンGGです。CCDカメラを使用した白...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5% ポビドンヨード	Amazon	NDC 67818-155-32	手術領域の非難聴的洗浄
70% エタノール	Thermo Fisher Scientific CAS	64-17-5	手術領域の非難聴的洗浄
アガロース	シグマ	A4718-256	ブラフィッシュチャンバーの準備ベル
ガモII	ソーラブス		多光子イメージング顕微鏡
ピバカイン	コーネル獣医ケア
GaAsP増幅PMT	ラボ	PMT2100	PMT検出器
ヒーター(800W)	ゼブラフィッシュ水用Finnex
キムワイプ	Kimtech		ゼブラフィッシュ調製用ラボ用組織
36 G 針付きナノフィルシリンジ (10 マイクロメートル)	WPI	NANOFIL + NF36BV	化パンクロニウム注射用シリンジと針
蠕動ポンプ	エレメンタルサイエン	ESI MP2	ゼブラフィッシュセットアップ用ウォーターポンプ
ポリエチレンチューブ(内径0.58mm、外径0.965mm)	エレメンタルサイエン	MP2ポンプチューブ	ゼブラフィッシュの口に入るチューブ
SR400	スタンフォードリサーチシステム	SR400	フォトンカウンター
標準フォトダイオードパワーセンサー	Thorlabs	S122C	パワー検出器
薄型ストリップボクシングワックス	コーニングゴム株式会社		ゼブラフィッシュチャンバー内のチューブの保持
ThorImage	Thorlabs		画像取得ソフトウェア
トリカイン (エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩)	MP	103106	ゼブラフィッシュの麻酔と安楽死
タイゴンチューブ (内径 1/16 インチ、外径 1/8 インチ)	ゼブラフィッシュの準備のための水流用	ゴン
VaporGuard	VetEquip	931401	イソフルランのリサイクル用
Vetbond 組織接着剤	3M	1469SB	マウスの頭蓋骨のガラス窓を接着し、魚を準備するときに実験用組織を接着します。
XLPLN25XWMP2	オリンパス		多光子励起専用対物レンズ

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