タイムラプス走査共焦点顕微鏡を使用した神経膠芽腫組織における腫瘍細胞遊走のイメージング

要約

出典: Parker, J. J., et al. 抗侵襲薬の腫瘍細胞遊走と患者特異的効果を研究するためのヒト神経膠芽腫器官型スライス培養モデル。J. Vis. 経験。(2017年)

このビデオでは、共焦点顕微鏡による緑色蛍光タンパク質 (GFP) を発現する神経膠芽腫組織スライスのイメージングを紹介します。高解像度の画像は、腫瘍細胞の動きと方向を追跡するために、一定の間隔でキャプチャされます。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所の IRB ガイドラインに従って実行されています。

1. レトロウイルスを発現する緑色蛍光タンパク質による腫瘍細胞標識

注

:腫瘍細胞遊走を分析するためのタイムラプス顕微鏡法では、スライス培養内の細胞の安定した長期蛍光標識が必要です。レトロウイルスは分裂細胞に選択的に感染し、それによってスライス内に存在するミクログリアや他の細胞型とは対照的に、腫瘍細胞集団内の蛍光標識を濃縮するため、レトロウイルスの使用が推奨されます。感染の標準化は、10⁴ CFU/μLのウイルス力価が、細胞遊走の追跡と分析に十分な緑色蛍光タンパク質の発現をもたらすことを示唆しています。ウイルス力価の増加、非選択的ウイルス(アデノウイルス、レンチウイルスなど)、またはすべての細胞を標識するその他の手段を使用すると、遊走中に明確な細胞境界を同定できず、分析が複雑になる可能性があります。代替蛍光マーカーの使用は、必要に応じて利用および最適化できます。

1. 腫瘍スライスの感染のためのレトロウイルスは、標準プロトコル5,14を介して、または市販の供給源から入手します。ウイルス上清を補充していないニューロン培地に適切な量を加えて希釈し、10⁴ CFU(コロニー形成単位)/μLのウイルス力価を達成します。
2. 7〜10日間の培養の間に、目的の腫瘍スライス培養物を5〜10 μLのウイルス(10⁴ CFU/μL)で感染させます。ウイルスを各組織スライスの表面にそっと滴下します。スライスがインサートの表面に浮いている場合は、追加される上清の量を減らします。スライス培養物を含むプレートをインキュベーターに戻します。
3. ウイルス感染後24時間から開始する標識腫瘍細胞のスライスを評価します。この時間遅延は、ウイルスの取り込みと蛍光遺伝子発現動態によって異なります。ここで使用したウイルスコンストラクトの場合、標準的な落射蛍光顕微鏡で堅牢な蛍光シグナルを観察するために72時間が必要でした。
   注:まれに、スライスがウイルス標識細胞の主に末梢分布を示すため、共焦点イメージングが複雑になる可能性があります。この複雑さを回避するには、スライスの厚さとスライス全体の厚さの変動を減らすようにしてください。スライス培養の中心付近に厚い領域がある場合、これは適切な栄養素の浸透を妨げ、活発に分裂する腫瘍細胞の集団を制限する可能性があります。この合併症をスクリーニングするための定性的アッセイは、テトラゾリウム色素試薬(すなわち、 MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-臭化ジフェニルテトラゾリウム))をスライス培地に添加します。試薬を添加した後、スライスの領域が青くならない場合は、代謝活性の欠如とスライスの健康状態の低下を示しています。

2.腫瘍細胞遊走のタイムラプス単一光子レーザー走査共焦点イメージング

注:形質導入が成功し、培養物の健全性が確認された後、細胞を対照条件下でイメージングし、続いて治療条件下で等期間のイメージングを行うことができます。このプロトコルを使用して、細胞は正常に画像化され、各条件で12時間追跡されました。ただし、イメージングと環境操作の期間が短くなったり長くなったりすることも有益である可能性があります。

1. 顕微鏡のロード<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. イメージングする前に、1 mLの新鮮なスライスメディアをガラス底の皿に入れます。
3. ガラス底ディッシュ内の培地をインキュベーターで15分間平衡化させます
   注:この時点で、蛍光共役レクチン(すなわち、ミクログリア標識用のイソレクチンIB4)またはリガンド共役量子ドットなどの可溶性標識剤をスライス培養培地に添加して、イメージング中の細胞亜集団を同定することができます。
4. 層流フード内の滅菌鉗子を使用して、画像化するインサートをガラス底皿に移します。皿を顕微鏡ステージに運びます。
ス
5. ライス培養物を密閉された顕微鏡ステージトップインキュベーターで37°Cおよび5%_CO2雰囲気で維持します。可能な場合は、インキュベーションチャンバーの滅菌H₂O加湿を利用して、過剰な培地蒸発を防ぎます(特に長時間のイメージング実験では重要です)。
6. 単光子および/または多光子用の長作動距離10倍空気対物レンズとレーザー励起を備えた共焦点顕微鏡を利用します。手記：顕微鏡の対物レンズが適切な作動距離を提供していることを確認してください。ステージトップインキュベーター、ガラス底ディッシュ、組織培養インサートからの高さが増えた結果、作動距離の長い対物レンズが重要になります。
7. ガラス底板を固定し、プラスチック製のペトリ皿カバーを取り外し、ガス透過性の膜で覆います。

画像取得<ol style='list-style-type:decimal;'>

顕微鏡を使用してスライスを目視検査し、スライスの端と中心の間に蛍光標識腫瘍細胞の適切な密度を持つ適切なフィールドを見つけます。イメージング中の組織シフトの感受性が高まるため、スライスの端にあるイメージングフィールドは避けてください。このシフトを制限するために、組織スライスハープを使用する場合があります。

多次元解析モードでイメージングソフトウェアを使用して、最初(下)と最後(上)のZスタック境界を設定し、イメージングするすべての位置に可視蛍光セルラーシグナルが含まれるようにします。150〜200μmのスライスを10μmの一定のZステップでイメージングすると、細胞経路を追跡するための適切な解像度が得られました(これは個々のイメージングのニーズに合わせて調整できます)。

顕微鏡に電動ステージがある場合は、Zスタックの取得ごとに十分な時間が確保されていることを確認してください。取得間の時間間隔を、位置ごとのスキャン時間 x 画像化する位置数 (つまり、画像化された腫瘍領域) に等しく設定します。
注:緑色と赤色の蛍光色素を同時に励起するには、488 nmと633 nmを同時に励起するデュアルラインレーザーラインスキャンプログラムを利用します。選択されるレーザー励起の波長は、発現する個々の蛍光タンパク質によって異なります。

画像化された腫瘍領域間で均一なレーザー出力と共焦点ピンホール設定を維持します。光毒性を制限するために、腫瘍細胞の本体とプロセスを明確に区別するために必要な最低レーザー出力設定を利用します。特定のイメージングパラメータ単位(つまり、パワーと共焦点ピンホールの設定)は、顕微鏡とレーザー光源の仕様によって異なります。

対

物レンズに向かって前進する焦点面に2〜3個の「バッファー」Zスタックステップを追加することで、潜在的な媒体蒸発を補正します。これにより、組織が垂直面のZスタック取得範囲から離れるのを効果的に防ぐことができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM 高グルコース	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A 培地、マイナス フェノールレッド	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 サプリメント (50X)、無血清	Invitrogen (Gibco)	17504-044
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)	インビトロジェン (Gibco)	15140-122
グルタマックスサプリメント	インビトロゲン (Gibco)	35050-061
L-グルタミン (200 mM)	インビトロゲン (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	インビトロゲン (Gibco)	15630-080
ナイスタチン懸濁	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10,000 unit/mL DPBS 中、無菌処理、BioReagent、細胞培養に最適
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	65.5 °C で溶融し、37 °C で流動的なままで、25 °C 以下で急速に硬化します。
Griffonia simplicifolia、Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher (Molecular Probes)	I32450	ミクログリア/マクロファージを標識するための培地に使用
pRetroX-IRES-ZsGreen1 ベクター	Clonetech	632520
Retro-X Concentrator	Clonetech	31455	ウイルス上清の非超遠心濃縮用結合樹脂
pVSG-G ベクター	Retro-X ユニバーサル レトロウイルス発現システム	クローンテ	631530
			トロ-X ユニバーサル レトロウイルス発現システムの一部
シアノアクリレート接着剤 (瞬間接着剤)	シグマ・アルドリッチ	Z105899	中粘度
ル・ア・ウェイ包埋モールド (スクエア - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	腫瘍サンプル埋め込み用金型
ステンレス鋼マイクロスパチュラ	フィッシャー サイエンティフィック	S50823	スプーン ブレードの首で 45 度曲げ器具
曲したフィッシャーブランド 解剖 細かい尖った鉗子	フィッシャー サイエンティフィック	08-875
片刃カミソリ ブレード (アメリカン セーフティ カミソリ)	フィッシャー サイエンティフィ	17-989-001	ブレードエッジの厚さは0.009インチです。圧着された鈍いエッジのカバーは、ビブラトームにロードする前に取り外します。
ライカ VT1000 S ビブラトーム	ライカ バイオシステムズ	VT1000 S
親水性 PTFE 細胞培養インサート	EMD ミリポア	PICM0RG50	30 mm、親水性 PTFE、0.4 μm 細孔径
35 mm ガラス底皿	MatTek	P35G-1.5-20-C スリーブ	ガラス径 20mm。カバースリップガラス厚 1.5
LSM 510 共焦点マイクロスコープ	Zeiss	LSM 510	10x エア オブジェクティブ (c-アポクロマート NA 0.45)
PECON ステージトップ インキュベーター	PeCON ドイツ	(生産終了)	インキュベーター PM 2000 RBT は、ツァイス顕微鏡用に設計されたコンパブル製品です。

液 は GP2-293 ウイルス包装細胞のック レピー 湾ック