アストロサイトにおけるコンパートメント特異的ダイナミクスのための自発的カルシウムイメージング

要約

出典: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019年)

このビデオは、原形質膜と小胞体に局在するカルシウム感受性タンパク質を順次モニタリングすることにより、アストロサイトにおけるコンパートメント特異的な自発カルシウム動態を観察するための蛍光イメージングを示しています。

プロトコル

1. Ca²⁺ イメージング

1. Lck-RCaMP2 および OER-GCaMP6f/
   を発現する星状細胞の自発的な活動の記録注: 画像分割光学系がなくても、原形質膜と小胞体 (ER) 周囲の Ca²⁺ シグナルを同じ細胞内で監視できます。ここでは、同じ星状細胞におけるLck-RCaMP2(原形質膜標的遺伝的にコードされたCa²⁺インジケーター)とOER-GCaMP6f(外小胞体膜標的遺伝的にコードされたCa²⁺インジケーター)の逐次記録について説明します。開口数が1.3を超える油浸対物レンズは、Ca²⁺の自発的な活性に強く推奨されます。
   1. 記録する前に、顕微鏡、カメラ、光源、顕微鏡加熱チャンバーの電源を少なくとも30分間オン
   にしてください。
   2. Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fでトランスフェクトされた細胞を含むカバーガラスを記録チャンバーにマウントし、400 μLのイメージング培地を加えます。チャンバーの上に蓋を置きます。
   3. GCaMP6fと光源(青色励起光、例:470〜490 nm、 材料表を参照)のフィルターセットを選択します。OER-GCaMP6fを発現する星状細胞を見つけます。
   4. RCaMP2のフィルターセットと光源(緑色の励起光、例えば510〜560 nm、 材料表を参照)を選択し、Lck-RCaMP2が同じ星状細胞で発現しているかどうかを確認します。光退色を防ぐため、光源への長時間の露出は避けてください。
   5. Lck-RCaMP2のタイムラプス画像を2Hzで2分間記録し、HDDに画像データを保存します。
   6. フィルターセットをGCaMP6fのフィルターセットに変更します。OER-GCaMP6fのタイムラプス画像を同じ視野で2Hzで2分間記録します。HDDにデータを保存します。
   7. 画像解析ソフトを使用してデータを解析します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18mmの円形カバーガラス	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	厚さ1、直径18mmの円形カバーガラス;代替カバーガラスを使用できます。
顕微鏡画像記録			CCDカメラ(例:浜松ホトニクス、OECA-ER)、EM-CCDカメラ(例:浜松ホトニクス、ImagEM;Andor、iXon)またはCMOSカメラ(例:浜松ホトニクスORCA-Flash4.0)Metamorph
(Molecular Devices)、Image J(NIH)、TI Workbench14(カスタムメイド)などの	画像解析ソフトウェア
ング培地とバッファー			に最適な培地またはバッファーを使用します。培地を使用する場合は、バックグラウンド蛍光を低減するためにフェノールレッドを含まない培地が望ましい。20 mM HEPESを加えて、二酸化炭素インキュベーターの外でpHを維持します。
IX73(オリンパス)やEclipse TI(ニコンインステック)などの	倒立蛍光顕微鏡
GCaMP6fイメージング			GFPに適したフィルター(励起、480 ± 10 nm、発光、530 ± 20 nm)
RCaMP2 イメージング			RFP に適したフィルター(励起、535 ± 50 nm、発光、590 nm ロングパス)
顕微鏡加熱システム			イメージング中に細胞を37°Cに維持するための加熱システム。熱膨張によるドリフトを避けるため、顕微鏡全体を覆う加熱システム(Tokai Hit、Thermoboxなど)を推奨します。
		用顕微鏡光源	銀ランプ(100 W)、キセノンランプ(75 W)、発光ダイオード(LED)照明システム(例:CoolLED Ltd.、precisExcite;Thorlabs Inc.、4波長LED光源。Lumencor、SPECTRA Xライトエンジン)。水銀の塊やキセノンランプの場合は、NDフィルターを使用して励起強度を下げてください。
微鏡対物			Plan-Apochromat油浸対物レンズは、ニューロンや星状細胞における自発的なCa²⁺活性の記録に強く推奨されます。
記録チャンバー	Elveflow	Ludin Chamber	この記録チャンバーは、直径18mmの丸いカバーガラス用です。
実体顕微鏡			馬の解剖に使用されます。オリンパスSZ60または同等の実体顕微鏡が利用可能です。

直径用カメラ冷却イメージ実験用顕微鏡フィルターセット 用の顕微鏡フィルターセット 励起水開口数が1.3を超える顕レンズ海