神経筋接合部の再生を研究するためのマウスの腓骨神経損傷の誘導

要約

出典: Dalkin, W., et al.腓骨神経損傷法 神経筋接合部を修復する因子を同定し、試験するための信頼できるアッセイJ. Vis. 経験。(2016年)

このビデオは、神経筋接合部 (NMJ) の再生を研究するためにマウスに腓骨神経損傷を誘発する外科的処置を示しています。この手順には、腓骨神経を露出させ、制御された圧力を加えて損傷を誘発し、軸索の再生をサポートするために神経外皮が無傷のままであることを確認することが含まれます。時間が経つにつれて、マクロファージは軸索の破片を除去し、神経修復と NMJ の再確立を促進します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 手術のための動物の準備

1. 滅菌 1 ml インスリン注射器による鼠径部皮下注射により、ケタミン (90 mg/kg) とキシラジン (10 mg/kg) の混合物でマウスを麻酔します。キャリア溶液には、0.9% 生理食塩水、17.4 mg/ml ケタミン、および 2.6 mg/ml キシラジンの混合物が含まれています。薬が効くのを待っている間、動物をケージに戻します。
   注:負荷量が処置期間中十分な麻酔を提供しない場合は、負荷量の25%を追加で注射することができます。
2. 注射後の動物を監視して、安定した呼吸数と覚醒レベルの適切な低下を確認します。後ろ足をつまんで覚醒レベルをチェックし、十分に麻酔しても反応を引き出さないはずです。
   注:これは通常、平均25〜30 gの若年成体マウスの場合3〜5分かかります。注射後10分後も動物がまだ反応している場合は、麻酔負荷量の25%を追加で注射することができます。
乾燥
3. を防ぐために、ワセリンと軽い鉱物油の点眼軟膏を動物の目に塗ります。動物をケージから取り出し、清潔で平らな面に置きます。電動ヘアトリマーを使用して、足から骨盤まで目的の後肢を剃り、手足の側面のみを露出させます。
4. 剃った部位に化学脱毛剤を1分間塗布します。実験用ワイプを使用して手動で毛を取り除きます。エタノールに浸した実験用ワイプで脱毛部位を洗浄します。

2. 外科的処置

:

1. オートクレーブまたはその他の適切な方法で手術器具を滅菌します。手術部位と手術ボードを80%エタノール/H₂Oで洗浄し、プロビドンで手術部位を消毒します。マウスを手術用ボードの上に置き、手足の拘束具に合わせます。対象の後肢を解剖学的に自然な位置に保ち、膝関節を内旋または外旋せずにわずかに伸ばします。
2. 動物とボードを手術用顕微鏡の下に置きます。表面のランドマーク、特に骨のある膝関節と前脛骨筋と腓腹筋の間の隆起の触診により、適切な切開部位に向けます。
一般的な
3. 鉗子で把持しながら、メスやバネハサミで皮膚を3cm程度切開します。切開部を総腓骨神経の下にあるコースに垂直にします。
4. 表在筋膜を切開し続け、大腿二頭筋と外側広筋を露出させます。接続する深部筋膜を切断して、これらの筋肉を分離します。1〜2cmのカットで十分です。
5. 機械式レトラクターを使用して大腿上腕二頭筋を尾側に引っ込め、総腓骨神経を明らかにします。
6. 腓腹筋の外側頭の腱との交差点が見つかるまで、神経を近位にたどります。
   注:露出には、収縮した皮膚と筋肉の追加の操作が必要になる場合があります。この交差点は、神経損傷の安定したランドマークとして使用されます。
7. 細い鉗子で神経をつかみ、先端を腓腹筋腱の外側境界に平行に合わせます。5秒間安定した強い圧力を加えて、総腓骨神経を粉砕します。
8. 手術用スコープによる目視検査により、神経の完全な圧着を裏付けます。怪我の部位では半透明に見えます。末梢軸索に蛍光タンパク質を発現するマウスを使用すると、損傷部位から蛍光が消えます。
9. レトラクターを取り外し、筋肉を解剖学的位置に再調整します。6-0シルク縫合糸で切開部位を閉じます。1〜3本の単純な断続縫合で十分です。回復マウスを清潔なケージの加熱パッドの上に置きます。
10. 手術後2時間、すべての動物を監視し、呼吸と麻酔に対する副作用をチェックします。手術から回復した直後に、鼠径部皮下注射によるブプレノルフィン0.05〜0.10 mg / kgの初期用量を投与します。次の 48 時間にわたって 12 時間ごとに 3 回の追加投与を行います。完全に回復したら、マウスを動物飼育施設に戻します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン	VetOne	501072
キシラジン	ロイド社	3437
ブプレノルフィン	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes	Kimtech	34155
電気カミソリ	Braintree Scientific	CLP-64800
80% EtOH/H₂O
10% プロビオジン
1 ml インスリンシリン
スプリングはさみ	Vannas	91500-09
No. 15 メス	Braintree Scientific	SSS 15
#5 鉗子	Dumont	11252-00
6-0 シルク縫合糸 逆切断針	縫合糸 Express	752B
げっ歯類加熱パッド	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 共役 α-BTX	分子プローブ	B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
オリンパス ステレオズーム顕微鏡	オリンパス	562037192
ツァイス 700 共焦点顕微鏡	ツァイス
可変流量蠕動灌流ポンプ	Fisher Scientific	13-876-3

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