無限の地平線インパクターを用いた片側頚髄損傷の打撲のモデル

サマリー

無限の地平線インパクターを用いて頚一方的な脊髄損傷を生成するための信頼性と再現性のある方法が記載されています。メソッドは、カスタム設計されたフレームを活用し、背骨を安定させるためにクランプします。標準化された手順と十分かつ持続的な傷害の生体力学的傷害のパラメータ結果。

要約

人間の脊髄損傷の大部分が脊髄に発生しながら、実験室での研究の大半は胸髄が負傷されている脊髄損傷（SCI）の動物モデルを採用しています。ほとんどの人間の脊髄損傷は脊髄が激しく避難骨や軟部組織に打たれ鈍、非貫通外傷（例えば、自動車事故、スポーツ傷害）の結果として発生するため、さらに、SCI研究者の大多数は意見である最も臨床的に関連する傷害モデルでは、脊髄が急速にcontusedであるものであること^1。したがって、人間の翻訳に向かう上での新規治療法の臨床評価の重要なステップは、内挫傷SCIのモデルでの有効性の評価です。頸髄。ここでは、採用して子宮頸部SCIの一方的な打撲のモデルの技術的な側面、その結果、解剖学的および行動の成果を記述する無限の地平線脊髄損傷インパクター。

Sprague DawleyラットはC5で左サイド片側椎弓切除術を施行した。損傷モデルの、生体力学的機能、および組織成果の再現性を最適化するために、我々は150 kdyn、22.5°（動物は22.5°で回転）の影響の軌道、インパクトの位置からの衝撃力を用いて脊髄をcontused 1.4 mmの正中線の。機能回復は、脊髄の白と灰白質の温存のために組織学的に評価した後、6週間までのシリンダ飼育試験、水平方向のラダーテスト、グルーミングテストおよび変更されたモントーヤの階段試験を用いて評価した。

ここに提示傷害モデルでは、脊髄への実験的なSCIモデルの重要な機能を一貫して再現性の生体力学的な力を与える。離散的な組織の損傷で、この結果、主にtに含まれている脊髄の外側半分にけがの彼は同側。怪我はよく動物の忍容性が、損傷後数週間で重要かつ持続的である前肢の機能障害の結果をしています。ここに提示頚部片側損傷モデルは、人間の翻訳の前に潜在的に有望な治療法を評価する研究者へのリソースかもしれません。

プロトコル

1。動物を保持するためのフレームとクランプデザイン：セットアップ

1. 動物を保持するフレームとクランプは無限の地平線（IH）脊髄損傷のインパクを収容するためにカスタム設計されました。
2. フレームのベースは、IH機器（ 図1A）に標準装備されているテーブルのガイドブラケットに収まるようにするために以下の寸法（30.2センチ×20.3センチメートル×1.3センチ）にカットアルミプラットフォームです。
3. 四Flexaframeサポートフットプレート（フィッシャーサイエンティフィック、トロント、ON）プラットフォームに接続されていると8 Flexaframeサポートロッド（フィッシャーサイエンティフィック、トロント、ON、30.5 cm）の8 Flexaframeサポートコネクタ（ 図1B）を使用して組み立てられています。
4. 中央の2本のロッドに接続された2つの追加のFlexaframeサポートコネクタ、家カスタムメイドは、クランプ（ 図1B）が保持しています。
5. 動物の脊髄は、垂直面に対して回転することによって角度がキーピンによって確立されグラムの場所で水平ロッドの一方と他方の水平ロッド（ 図2）の高さを変化させる。
6. クランプは高いと堅くC4からC6（ 図1C）の横突起の下でホールドをつかむために設計された7.6ミリメートルの顎の長さ35.6ミリメートル、25.4ミリメートルです。クランプの設計に関するその他の詳細については、Choo ら 、2009年以前に記載されている。

2。手術

1. 300〜350グラムの重量を量る雄Sprague Dawleyラット（チャールス·リバー）は、酸素（1 L /分）（誘導4％、メンテナンスのため2％）イソフルランで麻酔した。
2. 動物が麻酔の面の下になったら、動物を定位フレーム（Kopfは、タハンガ、CA）に配置されます。
3. リドカインの手術0.4mLを（20 mg / mLの。Bimeda - MTCアニマルヘルス株式会社、ケンブリッジ、オンタリオ、カナダ）の間に出血を最小限に抑えるためにエピネフリンとは、dorsumの複数形で手術部位の周りに筋肉内注射されていlの頸部。
4. 4〜5センチメートル背側正中切開は頭蓋骨の底部から開始し、尾側に拡張し、滅菌したメス（＃15）を使用して行われます。
5. 滅菌アドソン鉗子は、ぶっきらぼうに背骨に到達するために背側の筋肉を介して解剖するために使用され、無菌のALMトラクター（ファイン科学ツール、ノースバンクーバー、BC）は筋肉が広げ維持するために挿入されます。
6. 第15位メスを用いて、C4-C7のラミナを重ねて筋肉が正中線で開始し、横方向にそれらを席巻し、掻きされています。
7. 滅菌したメス（＃15）切開は、C6にC4の横突起の下にクランプを合わせるために背骨の両側に横突起に取り付けられた筋肉に行われています。
8. 無菌の罰金フリードマン·ピアソン骨鉗子（ファイン科学ツール、ノースバンクーバー、BC）傾けて、左C5ラミナは、慎重に硬膜と脊髄を視覚化するために削除されます。
9. 1.5ミリメートルの直径を有するロッドは腕の下にスライドさせるこれにより、わずかに背骨を引き上げ、クランプの挿入を容易にし、動物を下支えする。
10. C6にC4の横方向の横突起の上に無菌クランプの顎をマウントし、ネジを締めます。
11. ALMのトラクターを削除します。

3。脊髄損傷

1. クランプは動物にマウントされた後、動物はIHインパクターに移動​​されます。
2. クランプは水平方向のオフ22.5°の角度（ 図2）で固定されたフレームの2つの真ん中の棒上の金属ホルダーに挿入されます。
3. 動物が平らになるまで（VWR、ミシサガ、ON）、安定した高さ調整機能を提供し、シザーズジャッキは、最大発生します。
4. クランプは、クランプの上に小さなシリンダーレベルを置くことによって、ネジを締めて水平であることを確認してください。これは、すべてのネジが締まっているとセットがアップ、任意の移動を伴わない剛体であることが重要である。
5. 手順の残りの部分は、MICRの下に行われているoscope（ライカMZ8）。
6. インパクターの先端の中心がC6棘突起の頂部の上にホバリングされるまで、IHインパクター上の垂直調整ノブと2の水平調整ノブを使用したインパクターの先端（直径15ミリメートル、丸みを帯びたオフエッジを持つ）を下げるとを目指しています。
7. インパクターの先端が中央に配置されたら、y軸調整つまみ1とC5の中心にインパクターの先端を移動するには左側とx軸の水平方向の調整ノブに横方向に先端を移動するには、2つの第5ターン（1.4 mm）をオンにします。
8. それがインパクターの先端が灰白質の外側半分を目指していることを確認するだけ硬膜上になるまで先端を下げます。
9. 2は、硬膜上に先端4mmを高めるためになり、垂直調整ノブを回します。
10. インパクトエリアは、綿棒やスティックを使って、乾燥していることを確認してください。
11. プログラムに150 kdynに所望の力を設定し、衝突をトリガするために "スタートの実験"をクリックしてください。
12. 負傷した後、傷はレーで閉じられます5から0 vicryl縫合糸を使用したRS。ブプレノルフィン（0.03 mg / kgのSC、Temgesic、シェリング·プラウ·コーポレーション、ケニルワース、NJ）と生理食塩水（10mL）を、手術後二日間前に二回、毎日皮下投与されています。動物は密接に2週間と6週間後に怪我のために一週間1日2回監視されています。

4。代表的な結果

300〜350グラムの重さ二十九雄Sprague Dawleyラット（チャールス·リバー）を150 kdynの力設定で負傷した。インパクターの先端は垂直の22.5°からの角度で、正中線の外側1.4ミリメートルを目的とした。実際の力は155.55であった±0.73 kdynを意味します。平均変位は1512.72であった±27.86μmであり、速度は120.24であった±0.52 mm /秒（ 図3）。

行動アウトカム指標

機能回復は、テストをグルーミング、水平方向のラダーテスト、シリンダーの飼育試験を用いて評価したとモントーヤの階段テスト^1を変更^しました 。動物が怪我する前に訓練を受け、2、4、6週間後に傷害で評価した。実験期間を通じて持続的な重要な前肢の減損があった。

不規則な間隔の水平方向のラダーを越えて横断しながら水平方向のラダーテストは怪我する前に、動物は同側の前肢でのみ4.75±0.73パーセントの誤りを犯した。損傷後、動物は前肢エラーの割合の著しい増加を示した。同側の前肢パーセントの誤差はそれぞれ26.97±2.92パーセント、26.23±2.84パーセントと22.06±2.05パーセント2で、4〜6週間後の傷害、（ 図4A）であった。重要なのは、このテストで前肢障害は6週間持続した。

シリンダー飼育試験。探査時に同側の前肢（左+の両方）の使用率SCI後に有意に減少した。怪我する前に、動物は同側の前肢75.12±2.25％を使用。傷害後の動物は、同側の前肢8.59±2週間で1.80パーセント、14.25±2.65パーセント4週間と11.76±6週間（ 図4B）で2.66パーセントを使用していました。

モントーヤ階段試験を変更しました。同側の前肢で取得したペレットの数は、損傷後劇的に減少した。怪我する前に、動物は84.85を集め±食品の報酬の2.88パーセントです。しかし、2、4、6週間後のけがで、動物だけで30.91を取得±4.03パーセント、28.94±4.38パーセントと25.86±ペレット（ 図4C）の3.09パーセントです。

テストをグルーミング。損傷後のグルーミングスコアの劇的な減少がありました。 2.00±0.17、4週：1.83±0.17と6週間：1.79±0.11（ ふぃぎゅ SCI後、同側のグルーミングスコアは2週間でした再4D）。

組織の成​​果

白質とグレー物質温存。 150 kdynの力、22.5°および1.4 mmの横方向の目標の角度で脊髄損傷の例を図5に示されています。傷害は同側灰白質と白質に重大な障害をもたらした。皮質と赤核脊髄路の両方が負傷したと29の動物のうち23は、同側に含まれる実質の損傷を持っていた。白と灰白質の損傷の縦方向の範囲は吻方2400尾2400（ 図6）であった。白と灰白質の温存の "累積普及"（2000μmの吻側と震源の尾）の総推定を提供するためにセクションを追加する場合は、同側にのみ免れる白質51.8％、灰白質の39.7％を持っていた残りの反対側（ 図6）と比較されます。

図1。無限の地平線脊髄損傷インパクター。A.全体的な無限の地平線インパクターと設定します。 B.フレームを設定します。子宮頸部横突起を保持するためのクランプのC.クローズアップ画像。クランプ：D.仕様（インチ単位）。の推奨許容値<0.002（Choo ら 2009）。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。A.イラストと1.4ミリメートルの横を目的とし、0°（中性）AまたはB 22.5°の脊髄の回転を達成するために設定に対応するフレーム。

図3。無限の地平線インパクターの代表的な力と変位のグラフ。アローIインパクターの先端が20 kdynと変位の記録が開始されたポイントに達したことを時​​間をndicates。実際の力は、力対時間曲線のピークから読み取られると、それに対応する変位が計算されます。下のグラフは、典型的な150 kdyn挫傷、A.変位対時間のグラフ、B.力対時間のグラフを描いています。これらのグラフは、実際の達成力は152 kdynだったことを示し、コードへのインパクターの変位は、1287程度であることが測定された。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4。 150 kdynの力、22.5°と正中線の左の1.4ミリメートルの目的のインパク角度のための行動アセスメント。A.水平方向のラダーをテストします。 B.シリンダー飼育試験。 C.変更されたモントーヤの階段をテストします。 D.テストをグルーミング。同側の前肢が重要とsustaiの結果NED障害は反対側の前肢に比べて。

図5。吻側1600μmから尾1600μmの脊髄損傷の代表的な画像。

図6。組織学的評価。A. ％が白と灰白質免れる。被害の震源の2000μm付近の問題は、主に免れた。被害の震源の2000μm以内免れるB.累積白と灰白質。同側の側が大幅に少ない反対側に比べて、白と灰白質を免れていました。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

本稿では、150 kdyn、垂直のオフ22.5°の角度と、正中線から1.4 mmの横目的の力で無限の地平線（IH）インパクターを用いて子宮頸部片側挫傷モデルを説明します。これらの設定で、我々は、そのかなりのダメージが赤核脊髄、網様体脊髄、前庭と皮質路がすることが期待される地域に発生した登場し、主に同側の側に含まれている実質の混乱、と同側の前肢の持続的行動障害を生成することができました実行されます。このモデルの開発は、最適な傷害力、正中線の衝撃位置から、回転の度合いを確立した3一連の実験で発生しました。まず、150 kdyn以下傷害軍が十分かつ持続的な機能障害を生成しなかったことがわかった。さらに、コードを垂直（回転なしとIE）を打つインパクチップで、我々は頻繁にfのスパイクを観察したorce対時間曲線、インパクターの先端が脊柱管の腹側に骨を打ったことを示唆している。これらの動物の多くは、重度または持続的な機能障害を持っていませんでした。これと一致して、突然の力のスパイク、これらの動物の組織学的分析の損傷は、穏やかな、非常に横方向に脊髄内に配置された両方だった実質の損傷を明らかにした。そこで我々は衝突の軌道が垂直正中線の22.5°オフした...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
機器の名前	会社	カタログ番号	コメント
無限の地平線インパク	精度システムと計装	IH-0400
アルミニウム金属シート	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Flexaframeサポートフットプレート	フィッシャーズ科学	1466625Q
Flexaframeサポートロッド	フィッシャーズ科学	1466610GQ
Flexaframeサポートコネクタ	フィッシャーズ科学	1466620Q
クランプ1	カスタムメイド		Choo ら 。2009年
メタルホルダー	カスタムメイド		上記参照
インパクタ先端	カスタムメイド		直径：1.15ミリメートル
定位フレーム	デビッド·Kopfは楽器	モデル900
シリンダーレベル	YIJIA TOOLS	YJ-SL0620
顕微鏡	ライカ		モデル番号：MZ8
実験室シザージャッキ	VWR	12620-902