オリゴヌクレオチド結合蛍光マイクロスフェアを使用して複雑な臨床及び環境試料中の細菌の多重検出

Summary

我々は、オリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いて試料内の微生物の検出のための多重方法を説明します。サンプル内のすべての生物からのアンプリコンは、プローブ結合ビーズのパネルにハイブリダイズさせる。ルミネックスまたはバイオプレックス機器は、ビーズタイプとハイブリダイゼーションシグナルのための各ビーズを照会するために使用されます。

Abstract

細菌性膣炎（BV）はガルドネレラの膣、Atopobium鞘を含む細菌種の数、支配細菌に乳酸菌 -支配、および他の^1〜3の"通常の"微生物の変化によって特徴付けられる、定期的な複数菌症 ​​候群です。この条件は、HIV買収^4を含む負の健康アウトカム、の範囲に関連付けられており、それが臨床的に⁵管理が困難になる可能性があります。また、BVの診断は、様々な数値基準^6,7に得点されている膣スワブのスメアのグラム染色の使用に依存してきました。この診断は、シンプルで安価な、とよく資源が限られた設定に適していることが、それは主観的な解釈に関連する問題に苦しむことができますし、それが膣細菌⁸の組成の詳細なプロファイルを与えるものではありません。最近のディープシーケンシングの取り組みが持つ豊かな、多様な膣細菌叢を明らかにしたBV ^11,12の分子診断のための潜在的なターゲットの数の同定の結果になっています^9,10、通常考えられているそれらの個人、と比較してBVと診断された患者から採取したサンプルの間に明確な違い。これらの研究は、有用な情報を豊富に提供していますが、深いシーケンシングは、まだ臨床の現場での診断法として実用的ではない。我々は最近、急速にルミネックスプラットフォーム¹³上の検出とオリゴヌクレオチド結合蛍光ビーズを用いたマルチプレックス形式で膣細菌叢をプロファイリングするための方法を記載している。このメソッドは、現在のグラム染色ベースのメ​​ソッドと同様に、迅速かつ簡単ですが、プローブの設計の研究をシーケンシングに起因する分子の知識を悪用するというさらなる利点を追加します。このメソッドは、したがって、高い特異性と感度のカンプでBVを診断するために使用することができます膣スワブに存在する主要な微生物をプロファイルする方法を提供します半定量的かつ迅速な方法で、種の存在感と豊富で追加情報を提供しながら、グラム染色にared。この多重方式では、よく現在のところ、単一の試料¹⁴の5または6つの異なるアッセイに限定されている特定の生物の、現在の定量PCRアッセイの範囲を超えて拡張可能です。重要なのは、メソッドが膣スワブの細菌の検出に限定されるものではなく、容易に迅速に関心のほぼすべての微生物群集をプロファイルに適合させることができます。例えば、我々は最近、廃水処理プラントで使用する診断ツールの開発にこの手法を適用し始めている。

Protocol

このメソッドは、Dumonceaux らに報告された研究で使用されていました。J. CLIN。 。Microbiol 47、4067から4077、DOI：10.1128/jcm.00112-09（2009）。

全体的な手順を示す概略図を図1に示す。

1。ビーズカップリング

これは、（表2参照）ポリスチレンルミネックスのビーズへのオリゴヌクレオチドプローブをカップリングに使用する方法を説明します。ボリュームは、試験的に新しい捕獲プローブの評価のためにわずかに適応している、これらのボリュームは、括弧内に示されています。

1. -20℃のデシケーターから1 - エチル-3 - （3 - dimethylamiopropyl）カルボジイミド塩酸（EDC）粉を取り除くと、室温に温めてください。
2. その後、約20秒間ボルテックス、20秒のための水浴超音波処理でsonciationによって微小球を再懸濁します。
3. （これは5 × 10 ⁶または1.25倍に相当するエッペンドルフチューブに微小球の400μlの（100μl）を転送する10 ⁶ミクロス）。ルミネックスは、チューブに付着し、ビーズの回復を妨げることから、非結合ビーズを防ぐために、低タンパク結合....

Discussion

信号発生の特異性は非常に重要であり、あなたが本当に観測される信号は、その生物から生成されたアンプリコンの検出を反映していることを確信している必要があります。このようなPrimerPlex（プレミアBiosoft）などのソフトウェアは、効率的にハイブリダイズするプローブを設計するために役立ちますが、非対象種にクロスハイブリダイズしない場合があります。このプロトコルで説明されているようにユニバーサルPCRプライマーが使用されている場合、それは生成されたアンプリコンがサンプル中に存在する生物のすべてを表すことを覚えておくことが重要です。それはcpnDB、cpn60 UTシーケンス¹⁶のデータベースにプローブ設計ソフトウェアによって提案された配列を比較することにより、クロスハイブリダイゼーションの可能性のための潜在的なプローブを分析することが重要であり、複数の生物に一致するプローブは、可能であれば避けるべきです。 。さらに、潜在的に特異的なプローブが特定された時、我々は検証をプローブするアプローチを採用しているこれで複雑な、人工的なTEmplateが関心¹³の細菌に関連付けられている.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
オリゴヌクレオチド名	会社	シーケンス1
H279BP	Invitrogen社、IDT、または他の	ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGIGAYGGIACIACIAC
H280		YKIYKITCICCRAAICCIGGIGCYTT
H1612BP		ビオチン- OEFO GAIIIIGCIGGYGACGGYACSACSAC
H1613		CGRCGRTCRCCGAAGCCSGGIGCCTT
1O、ホスホロチオエート- C、E、ホスホロチオエート- G、F、ホスホロチオエート- A、I、イノシン、Y、CまたはT、R、またはG、K、TまたはG、S、CまたはG

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
1 - エチル-3 - （3 - dimethylamiopropyl）カルボジイミド塩酸（EDC）	ピアース	22980
蛍光ポリスチレンビーズ：MicroPlexミクロスフェア（ルミネックス）、またはバイオプレックスCOOHビーズ（Bio - Rad社）	ルミネックスまたはBio - Rad社	Bio - Rad社：xxxはビーズ識別子に対応する171 - 506xxx	磁気ビーズは、オリゴヌクレオチド結合のために利用可能になりつつあると特定の利点を提供することがあります。これらの著者が試行されていません。
キャプチャーオリゴヌクレオチド（5'アミノC12改）	Invitrogen社、IDT、または他の	様々な	脱塩の純度レベルは許容範囲です。膣スワブを特徴付けるために使用される捕獲プローブの配列は、このプロトコルは13基となる原稿に記載されています。
T7エクソヌクレアーゼ	ニューイングランドバイオラボ	M0263S
ストレプトアビジン- R -フィコエリスリン（SA - PE）	インビトロジェン	S - 866	高純度SA - PEを取得するために注意が必要なのは、このカタログの数は推奨されます
サーモウェル、96ウェルPCRプレート	フィッシャー	CS006509	96ウェルサーモサイクラーとBioPlexマシンの両方に適合
サーモシールマット	フィッシャー	CS006555	再使用することができます。石けん水で洗浄は、よくすすぎ、および乾燥
5M TMAC	シグマ	T3411
バイオプレックスまたはルミネックス楽器	Bio - Rad社またはルミネックス	Bio - Rad社：171-000201
プローブ設計のためのPrimerPlexソフトウェア	プレミアBiosoft	www.premierbiosoft.com	ルミネックスプローブドのために提案他のソフトウェアプラットフォームを使用することができますが、署名

コンポーネントは	μL/アッセイ	μl/100アッセイ	最終濃度
10 × PCR緩衝液（Invitrogen）	5	500	1X
50mMのMgCl 2の （Invitrogen社）	2.5	250	2.5mMの
の10mMのdNTP	1	100	0.2mMの各
H279BP、25μM	0.25	25	375 nMの
H1612BP、25μM	0.75	75	125 nMの
H280、25μM	0.25	25	375 nMの
H1613、25μM	0.75	75	125 nMの
水	34	3400	---
合計	44.5	4450