の可視化線虫（Caenorhabditis elegans）キューティクルの構造

Summary

我々は、ライブでキューティクルを可視化する手法を提案 C.エレガンス一般的に使用される赤色蛍光親油性色素DII（1,1' - ジオクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を使用して、 C.エレガンス環境的に露出した神経細胞を可視化する。この最適化されたプロトコルで、alaeと環状のクチクラ構造は、DIIによって染色し、化合物の顕微鏡を用いて観察される。

Abstract

C.のクチクラelegansは動物^1-4の外側を取り囲む非常に強い構造です。キューティクルだけではなく環境から動物を保護するだけでなく、ボディの形状を決定し、運動性^4-6に役割を果たしている。表皮細胞から分泌されるいくつかの層は最も外側の脂質層^7を含む、キューティクルを構成しています。

キューティクルの円周尾根はannulusの複数形のパターン動物の長さと呼ばれ、開発⁸のすべての段階で存在している。 AlaeはL1、dauer、そして大人のステージ^2,9を含む開発の特定の段階で、中に存在する縦方向の尾根です。クチクラコラーゲンの組織に影響を及ぼす遺伝子の変異は、クチクラ構造と動物の体の形態^5,6,10,11を変更^すること^ができます。 DIC光学系と化合物の顕微鏡を使用してクチクラのイメージングが可能ですが、クチクラ構造を強調する現在の方法は、蛍光を含むセントジーン発現^12、抗体染色^13、および電子顕微鏡^1。ラベルの付いた小麦胚芽レクチン（WGA）もクチクラ糖タンパク質を可視化するために使用されていますが、細かいクチクラ構造^14を解決するために制限されています。蛍光色素を使用してクチクラ表面の染色が観察されたが、詳細に¹⁵に特徴がないされています。我々は、ライブCでキューティクルを可視化する手法を提案一般的にC言語で使用されている赤色蛍光親油性色素DII（1,1' -ジオクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩）を、使用して虫elegansの環境にさらされるニューロンを可視化する。 DIIの染色のためのこの最適化されたプロトコルは、annulusの複数形、alae、外陰部、男性の尾、およびCの雌雄同体尾のスパイクの高分解能蛍光可視化するための、シンプルで堅牢な方法です。 エレガンス 。

Protocol

1。 DIIの調製染色

1. DMF中20 mg / mLのDII（Biotium、（株）、ヘイワード、カリフォルニア州）のストック溶液を調製。 DIIは、敏感な光なので、ホイルで包むことによって光からDIIを保護する。
2. 各集団に対して399.4μLM9は0.6μLDIIの株式を追加することにより、DIIの希釈率を作成します。これは、30μgの/ M9のmLのDIIの最終的な希釈率を与える必要があります。これは、同時に複数の集団を染色するためにスケールアップすることができます。ホイルにチューブ（s）をラップすることによって、光からシールドDII。

2。線虫の調製

1. 汚染されていない線虫の人口を含む60 mmのプレートを使用してください。静かにすべての幼生と成体の動物を緩めるために板の表面全体に円を描くように液体を渦巻くことでM9バッファーに0.5％トリトンの解X - 100を用いてプレートから動物を洗う。滅菌済み1.5 mLチューブに洗って移す。
2. すぐに30秒間2000rpmで動物をスピンダウン。できるだけ多く渉取り外して廃棄チューブの底に動物の質量を邪魔することなく可能な限りernatant。
3. 残留トリトンX - 100を削減するために、M9バッファー、スピンを使って動物をすすぎ、そして上清を除去します。一度この手順を繰り返します。
4. 溶液中で動物を懸濁するた....

Discussion

ここで紹介するDIIの染色法は、C. elegansのキューティクルを視覚化するため、比較的迅速かつ便利な方法が可能になります。一般的に画像環境にさらされる感覚ニューロン^15,17に使用される方法を再利用して最適化することにより、DIIは、蛍光alaeと環状構造（図1および図2）だけでなく、外陰部、男性の尾、および両性テールスパイクの両方を染色するために使用することができます（図3）。我々は、インキュベーション溶液と時間が常にキューティクル（表1、図4）を染色するためにDIIの能力に影響を及ぼすことを見出した。 DIIの染色環境にさらされるニューロンのための方法は、トリトンX - 100 ¹⁵とM9で2時間のインキュベーション時間を使用しています。界面活性剤とM9の初期洗浄には、トリトンX - 100は、クチクラ表面から汚れを除去する手助けをし、凝集から動物を防ぐことができます。しかし、同じバッファ内の染色液中での動物三時間インキュベートするキューティクル（表1）染色から色素を防ぎます。これは、洗剤の溶液中で長期の治療によって取り除かれている線虫の表面の脂質が原因である可能性.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	シノニム	会社	カタログ番号	コメント
DII	1,1' - ジオクタデシル- 3、3,3'、3' - tetramethylindocarbocyanine過塩素酸塩	Biotium、（株）	60010	株式の希釈： DMF中20 mg / mLの 希釈率：30 mg / mLの
DMF	ジメチルホルムアミド	Sigma - Aldrich社、（株）	D4551
トリトン X - 100	オクチルフェノキシポリエトキシエタノール	VWRインターナショナル、LLC。	EM - 9410
M9	22mmのKH 2 PO 4、42mmののNa 2 HPO 4、86mMのNaCl、1mMのMgSO 4を
NGM	線虫の増殖培地	IPMサイエンティフィック株式会社	11006-501	NGM寒天プロトコル18に従って調製することができる
寒天		EMDケミカルズ（株）	1.01614	水、4％
レバミゾール	塩酸レバミゾール	Sigma - Aldrich社、（株）	31742	100μM - 必要に応じて、1 mMのレバミゾール
顕微鏡スライド		VWRインターナショナル、LLC。	16005-106
顕微鏡のカバーガラス		VWRインターナショナル、LLC。	16004-302
化合物の範囲		カールツァイス株式会社	A1m	実験のニーズに合わせて目標を使用
TRITCまたは他の互換性のあるフィルタ	＆ニッポン放送p;	クロマテクノロジー株式会社	49005	ET - DsRedタンパク質は、（TRITC/Cy3）フィルタセットをスパッタ