バイオメディカル応用のためのアルギン酸ミクロスフェアの生成

ここでプロトコルは多層アルギン酸マイクロビーズ（ 図1）を生成するための3つのステップの手順について説明します。まず、アルギン酸マイクロビーズ（ 図2A）が形成されている。この手順は、以下のセクション1に記載されている。細胞やタンパク質は、配信システムとして動作するために、このステップのマイクロビーズに追加することができます。次のステップでは、マイクロビーズ上に選択透過層の形成を含み、第2章で説明されています。最後のステップは、追加のアルギン酸塩層の形成を伴い、第3節で説明されています。ビーズの表面（ 図2B）の外側にこの層の形態は、移植後のシステムへの細胞応答を誘導する治療用分子（ 図2C）をカプセル化し、提供するために使用することができます。

1。アルギン酸マイクロビーズの調製

1. 1mL中にLVMアルギン酸の15グラムを溶解することによって1.5％（w / v）のLVMアルギン酸溶液を調製内層アルギン酸塩溶液（25 mM HEPES緩衝DI水にある118軒のNaCl、5.6 mMの塩化カリウム、2.5 mMのMgCl _2、pH7.4に調整）。アルギン酸塩の電源が完全に透明で粘性のある溶液を形成するために溶解するまでボルテックスで混和します。注：このプロトコルは、アルギン酸マイクロカプセル内の膵島のカプセル化のための最適な条件を記述する¹アルギン酸ミクロスフェアの濃度と組成は、他のアプリケーション（例えば、薬物送達、組織工学など）に注意するためのプロパティを調整するために変更することができます。膵島のカプセル化膵島microencapsulatorにロードする前にこの段階でアルギン酸塩溶液に添加することができます。
2. DI水に100 mMのCaCl ₂及び10mMのHEPES緩衝液に溶解し、pH7.4に調整することにより、架橋溶液（純水で22 mM CaCl _2を ）準備します。注意：このようなBr ^2のような他の二価陽イオン^+、Srの^{2 +}などがアルギン酸ゲルdの性質に応じて、Ca ^{2 +の}代わりに使用することができますesired。
3. シリンジに25ゲージの針を追加することにより、2チャンネルエアジャケットアルギン酸microencapsulatorを設定し、針がエアジャケットの中央にあることを確認するために、各側にバルブを調整します。異なるゲージの針がターゲットアルギン酸マイクロビーズのサイズに応じて、このステップに使用することができます。
   このステップはまた、注射器で行うことができ、microencapsulatorが使用可能であるべきではありません。シリンジにアルギン酸塩溶液を追加し、希望するマイクロビーズのサイズに基づいて、ニードルゲージを選択します。
4. 直接針の下に架橋溶液10 mLを入れたフラスコを置きます。溶液中で攪拌棒を配置します。
5. マイクロビーズを形成するために、アルギン酸を架橋するためには、CaCl ₂溶液に直接滴を注入します。連続的に攪拌しながら、少なくとも15分間硬化させるために架橋溶液中でビーズをインキュベートします。
6. 15 mLの遠心チューブにビーズを転送します。 、残液を除去すると2分ごとに生理食塩水で0.2％CaCl ₂で3回洗浄を行います。

2。ポリ-L-オルニチンでコーティングMicroBeadsを

1. 生理食塩水のポリ-L-オルニチン（PLO）の0.1％（w / v）溶液3 mLを準備します。それは完全に透明な溶液を形成し、溶解するまでボルテックスでソリューションを配置します。ポリ-L-リジン（PLL）は、選択透過性と同様のレベルで、その結果このステップのためにPLOの代わりに使用できます。
2. PLO溶液にアルギン酸ビーズを転送します。ポリカチオン、ポリアニオン複合体を形成し、アルギン酸塩と相互作用するPLOに十分な時間を可能にするために30分間ボルテックス上に置きます。 30分の終わりには、アルギン酸マイクロビーズ周りにはっきりと見える白いコーティングがあるはずです。
3. PLOのソリューションを削除し、2分ごとに生理食塩水0.2％CaCl ₂で3回洗浄を行います。

3。外アルギン酸を作成するには、レイえー

1. 外側の層を作成するために使用される所望の濃度のアルギン酸塩溶液を準備します。 （1.1）上記のような溶液を調製する。外層のサイズは、（ 図3）を使用アルギン酸の組成および濃度の影響を受けています。
2. セルストレーナーにアルギン酸ビーズを転送します。可能な限りマイクロビーズを乾燥するために、余分な溶液を吸収するためにキムワイプを使用しています。
3. パラフィルムの表面にマイクロビーズを転送します。必要に応じて、例えば、ガラスあるいはプラスチック製のペトリ皿のような他の滑らかな表面は、パラフィルムの代わりに使用できます。
4. アルギン酸マイクロビーズ上（3.1）で調製したアルギン酸塩溶液を転送します。アルギン酸溶液の体積は、完全にアルギン酸ビーズをカバーする必要がありますすることができます。マイクロビーズは、45分間アルギン酸塩溶液に残ってみましょう。
5. マイクロビーズに結合していない過剰なアルギン酸塩溶液を削除するには、ピペットを使用しています。
6. のマイクロビーズを転送22mmのCaCl ₂の溶液へ。これは、別個の外側のアルギン酸塩層を形成し、その結果、マイクロビーズの周りにアルギン酸塩溶液を架橋。
7. 2分ごとに生理食塩水に22 mMのCaCl ₂で3回洗浄を行います。顕微鏡下でマイクロビーズを表示すると、コアのマイクロビーズの周りに形成され見られるように別個の外側のアルギン酸塩層のために許可する必要があります。

4。代表的な結果

図1多層アルギン酸ビーズを作成する手順の概略。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。

図2（A）と（B）アルギン酸マイクロビーズの位相コントラストイメージです。 （）マイクロビーズを示しています。後の合成工程（1.7）、（B）ステップ（3.7）の完了後に存在する別個の外側のアルギン酸塩層を表示した。 （C）外側の層にカプセル化された蛍光標識したBSA蛋白質のFITCイメージです。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。

図は3つ。外側のアルギン酸塩層のサイズが使用アルギン酸塩の組成及び濃度に基づいて変化させることができる。我々の結果は、増加するアルギン酸塩濃度を有する外層のサイズが増加すると、LVMおよびLVGアルギン酸の両方の、ことを示し、そのLVGアルギン酸塩は、同じ濃度でLVMアルギン酸よりも厚い外層が得られます。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月95（2）、632から40（2010）。

FGF-1の図4。リリース、外側のアルギン酸塩層からの血管新生増殖因子タンパク質は、使用するLVMとLVGアルギン酸塩の濃度に基づいて変化した。 （A）と（B）％の放出を示し、（C）と（D）別の外層製剤の時間に対するFGF-1の対応する質量放出を示す。すべての初期5時間（AとC）内の条件、30日（BおよびD）までの低線量連続リリースのために展示バースト放出があります。 Khanna らから許可を得て複製。 J BIOMEDマーテル解像度A. 11月; 95（2）、632から40（2010） 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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