FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）ベースの記者1は、生きた細胞中の内因性キナーゼとホスファターゼ活性の評価を可能にする。このようなプローブは、一般的にリン酸化可能なシーケンスとリン結合ドメインによる介入CFPとYFPの変異体、で構成されています。効率（図1）、FRETの変化につながる、CFPとYFPの間の距離や方向の変化をもたらすリン酸化の際、プローブの変更のコンフォメーション、。いくつかのプローブは、PKA 2、PKB 3、PKC 4、PKD 5、ERK 6、JNK 7、CDK 18、オーロラB 9の記者とPLK1 9を含む複数のキナーゼとホスファターゼの活性のバランスを、監視し、過去10年間の間に発表されている。モジュラー設計を考えると、追加のプローブは、近い将来10で出現するものと予想される。
細胞周期の進行は、ストレスsignaliによって影響されるngは11パスウェイ。特に、細胞周期が細胞周期を通じて細胞の細胞がストレスを12から回復している。タイムラプスイメージングでは、したがって、特に注意を必要とする場合に比べて成長を摂動の間に異なる規制されています。レシオメトリックイメージングを採用する場合は特に対ノイズ比の高い信号を持つ2つのイメージが正しく結果を解釈するために必要とされるので、これは、問題になります。キナーゼとホスファターゼ活性で細胞周期依存性変化のレシオメトリックFRETのイメージングは、主に細胞周期8,9,13,14のサブセクションに限定されています。
ここで、我々は、人間の細胞周期を通してレシオイメージングを用いたFRETに基づくプローブを監視する方法について説明します。方法は、ライフサイエンスにおける多くの研究者に利用可能であり、顕微鏡や画像処理の専門知識を必要としない機器に依存しています。
プロトコル
1。細胞にプローブを導入する
- FRETに基づくプローブとプラスミド耐性を付与するとの同時トランスフェクション細胞。目的の細胞型で効率的なトランスフェクションの方法を選択してください。 U2OS細胞の場合は、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法では十分な結果が15を与える。
- 少なくとも7日間に適切な抗生物質でセルを選択します。これは豊かにプローブを発現する細胞の量をし、深刻な細胞周期に影響を与える毒性発現レベル、または発現レベルと細胞の量を制限します。
- （省略可能）安定したクローンを選択してください。
- 固定またはライブセルを使用して、CFPとYFPの両方がほぼ同じ比率ですべての細胞に存在することを確認してください。
- 一部の細胞だけCFPまたはYFPを含む場合には、組換えは可能性が発生しました。組換えは、細菌の増殖の間またはプローブのトランスフェクション後にどちらかが発生することができ、後者の場合にはプラスミドの品質に依存することがあります。プラスミドpを繰り返す償いと問題が解決しない場合はトランスフェクション前にプラスミドを線形化します。
2。レシオメトリックを監視すると、FRETの
- チャンバー内にマウントするためのガラスボトムディッシュ、またはカバースリップ上にシード細胞。食器/カバースリップがない1.5（170μm厚....
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ディスカッション
細胞周期を通してFRETを監視することで外部からの刺激に短期的応答を評価する際には、あまり重要な考慮事項が必要です。最初に、細胞周期の進行が容易にその光毒性を最小限にとどめる必要、ストレスのシグナリングによって摂動されています。第二に、すべての記者たちが潜在的にキナーゼ、ホスファターゼまたは相互作用ドメインを滴定することによって細胞プロセスに影響を与える可能性があります。実験条件が適切かどうか見極め、おそらく最も簡単な方法は、有糸分裂から細胞分裂する細胞周期の長さを測定し、プローブの蛍光イメージングと表現の独立した実験と比較することです。
モニタリングの重要な要因は、高解像度で美しい画像を取得するために誘惑に耐えられるようになる細胞周期を通して比率のFRET。正確な設定は、顕微鏡システムや発現レベルの感度と特定のプローブの性質に依存するが、それは使用することが重要です。何に対応するビニングのレベルは確認することは絶対に必要です。 CFPex間の時間が - YFPemとYFPex - YFPemイメージは我々の手で、細胞の形態変化を避けるために短くする必要があるそれ以上の0.1秒で露.......
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開示事項
我々は、開示することは何もない。
謝辞
著者らは、スウェーデンの研究評議会、スウェーデン戦略研究財団、スウェーデン癌の社会、スウェーデンの小児がんの社会、オーケWibergs基盤とJeanssons基盤によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | カタログ番号 | 会社 | |
| リーボビッツL - 15、無フェノールレッド | 21083-027 | GIBCO、Life Technologies社によって | |
| DMEM +グルタミン- I | 31966 | GIBCO、Life Technologies社によって | |
| ウシ胎児血清（FBS） | SV30160.03 | HyClone | |
| 0.05％トリプシンEDTA | SH30236.01 | HyClone | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | SV30010 | HyClone | |
| DPBS | 14287 | GIBCO、Life Technologies社によって | |
| ピューロマイシン | P8833 | シグマアルドリッチ |
参考文献
- Sun, Y., Wallrabe, H., Seo, S. A., Periasamy, A. FRET microscopy in 2010: the legacy of Theodor Forster on the 100th anniversary of his birth. Chemphyschem. 12, 462-474 (2011).
- Allen, M. D., Zhang, J. Subcellular dynamics ....
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再版と許可
