我々は、無傷のマウス網膜から桿体と錐体の光応答を取得するためのtransretinal電図（ERG）の録音の比較的簡単な方法について説明します。このアプローチは、それらの光反応を分離し、分離されたフラットマウントされている網膜の間に配置フィールド電極を使用してそれらを記録する光受容体からシナプス伝達のブロックを活用しています。
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この記事について
サマリー
要約
ロッドとコーン：脊椎動物の網膜に結像光受容体の2つの別個のクラスがあります。ロッドは、コーンが急速に明るい光条件の変化の下で継続的に動作するのに対し、光の単一光子を検出することができます。光受容体の外側のセグメントのロッドとコーン特有の視覚的な顔料による光の吸収は、最終的に細胞膜と細胞の過分極における環状ヌクレオチド依存性チャネルの閉鎖につながる光情報伝達カスケードをトリガします。現在および潜在的な膜で、この光誘起変化はどちらか古典的な吸引電極記録手法1,2、または薬理学的にブロックされたシナプス応答コンポーネントを3月5日孤立網膜からtransretinal電図記録（ERG）によって、光応答として登録することができます。後者の方法は、マウスの光受容体からの薬物がアクセス可能な長期的な録音を可能にし、安定した光応答frを得るために、特に便利です。OM乏しいと壊れやすいマウスコーン。円錐の場合には、そのような実験は暗順応6,7の間にコーン感光性回復のプロセスを監視するために、両方の本質的にすべての視覚色素を漂白暗順応条件と、以下の強烈な照明で行うことができます。このビデオでは、ロッドと暗順応マウス網膜からM / L-錐体主導transretinal録音を実行する方法を示します。ロッドの録音は、野生型（C57BL / 6）マウスの網膜を用いて実施される。 8シグナル伝達ロッドを欠くマウスを簡単にするために、コーンの録音は、遺伝子組換えロッドトランスデューシンαサブユニットのノックアウト（ - / - Tα）から取得されます。
プロトコル
1。電極を作る
- ガラス電極を準備します。 120mgの寒天を量り、10 mLの蒸留水（最終寒天濃度1.2％）でそれを混ぜる。湯浴中で寒天溶液を溶かす。プラスチックシリンジを用いて寒天溶液を用いて：ガラスキャピラリー（長さ= 100ミリメートル、外径/内径= 1/0.75 mmとし、内部容積= 44μL我々は以下の寸法を使用してWordのPresisionインスツルメンツTW100-4キャピラリーを使用します）を入力します。室温で10分間寒天を固める。したがって、最大約200毛細血管が（寒天混合物の残りの部分は-4℃と、再使用されるいくつかの時点で保存することができます）入力することができます。
- ダイヤモンドナイフを使用して半分に毛細血管を切った。
- 4℃で少なくとも24時間のマウス電極溶液中で得られたガラス電極を浸す4℃で電極を保存し、3〜4ヶ月の期間にわたってそれらを使用します。
2。実験のセットアップ
- 一晩マウスを暗適応します。 （例えば、C野生型を使用します。57Bl / 6）ロッド駆動型transretinal録音とTのα - / -マウスコーンtransretinal録音8シグナリングロッドを欠損したマウス。
- 1リットルの潅流液を、100mLの電極液、20mLのインキュベーション溶....
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ディスカッション
ロッドとコーン主導transretinal ERG記録法は、野生型および遺伝子改変動物の両方で、マウスの光受容体の機能を調べるための強力なツールになっている上記の。基本的な光応答特性の簡単な特性に加えて、この単純な手法に近いから無傷の網膜の準備で実行長期的な実験中に大きな応答の安定性を提供します。野生型マウスの暗順応ロッドの最大応答振幅と感光性の両方が録音の開始から少なくとも1時間以内に安定であり、暗順応コーンの最大振幅と感光性は、通常の30〜40分後に10％以上減少していないレコーディング。この技術の他の利点は、生きた動物ERG記録を行うために必要な古典的な単一セルの吸引マウスの光受容体からの録音、および麻酔のない状態で到達不能である簡単な薬理学的操作への従順であり、イングス。 - / - Tαの網膜を使用してコーンtransretinal録画用8シグナルを排除棒のマウスラインは実質的に実験手順と結果の解釈が容易になります。これは、明るい照明、そして/または安定した背景光の存在下で勉強して円錐関数への曝露後、マウスの錐体視覚色素の再生を監視することを目的とした実験では特に重要です。したがって.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もありません。
謝辞
失明とEY02687（ワシントン大学眼科視覚科学部）を防ぐため失明を防ぐための研究からキャリア開発賞、NIHの助成金EY19312とEY19543（VJK）によって、同様の研究から無制限の助成金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 材料名 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| DL-AP-4 | バイオサイエンスTOCRIS | 0101 | ||
| すべての他の試薬 | Sigma-Aldrich社 | |||
| ガラスキャピラリー | 世界の精密機器 | TW100-4 | 電極を作るため | |
| ろ紙 | HARG | ミリポア | HABG01300 | |
| 光度計 | UDTインスツルメンツ | S350 | 光キャリブレーションのために | |
| 放射シリコンセンサ | UDTインスツルメンツ | 221 | 光キャリブレーションのために | |
| 防振テーブル | テクニカル·マニュファクチャリング株式会社 | TMC 78から239-02R、TMC63-26012から01 | メカニカルノイズを最小限に抑えるために | |
| エアコンプレッサーパンサーP 15TC | ウェルテルインターナショナル | P 15TC | 防振テーブルに接続 | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | MZ9.5 | マウスの眼の解剖のために | |
| 赤外線イメージコンバータ | BEMeyers | ProwlerTM | 実体顕微鏡にバインドされている | |
| 差動増幅器 DP-311 | ワーナー·インスツルメンツ | DP-311 | ||
| 軸索Digidata 1440Aデジタイザ | ; | モレキュラーデバイス | 1440A | |
| デュアルチャネル8極フィルタ | クルーン-HITE株式会社 | 3382 | ||
| セラミック抵抗 | TEの接続 | CGS SBCHE618RJ | 灌流液を加熱するための | |
| 熱電対 | T | Physitempインスツルメンツ | IT-18 | |
| 温度モニター | オメガ | DPi32 | 熱電対に接続 | |
| LEDは505nmの | TTエレクトロニクス/ Optek Technology種類 | Digi-KeyのP / N 365-1185-ND | テストが点滅/漂白ライトを適用するには | |
| 焼灼ペン | Bovie | AA25 | 背の部分をマーキングするためのマウスの眼球の | |
| 10電気生理学的データ収集と解析ソフトウェアをpCLAMP | モレキュラーデバイス |
参考文献
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- an....
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再版と許可
