このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています生体/ ex vivoでの直流（DC）電界（EFS）を指示する走電性および他の細胞応答を調べるために、単一細胞レベルでの経時的記録を使用します。
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方法論記事
2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
内因性電界（EFS）は、生体内で自然に発生し、中枢神経系の1,2のことを含め、組織/臓器の開発と再生時に重要な役割を果たしている。これらの内因性排出係数は、細胞や組織の電気抵抗と組み合わせてイオン輸送の細胞調節によって生成されます。それが適用され、EF治療は、動物およびヒトにおける3,4 -脊髄損傷の機能的な修復を促進することが報告されている。特に、EF主導細胞遊走は、神経前駆細胞（NPCに）7,8を含む細胞の種類5,6、多種多様な、で実証されている。直流（DC）排出係数の適用は、ほとんどの研究室で一般的に使用可能なテクニックではありません。我々は以前5,11細胞や組織文化へのDCの排出係数の適用のための詳細なプロトコルを記述している。ここでは2Dを設定するには、計算された電界強度に基づいて、標準的な方法のデモビデオを提示dは3DはNPCのための環境、および2Dの単一細胞の成長条件、および3Dの器官脊髄スライスの両方でEFの刺激に対する細胞応答を調査する。 cytoarchitectonic組織の組織が 十分にこれらの培養9,10内に保存されているため、脊髄cordsliceは、移植後、NPC ex vivoでの動作を研究するための理想的な受信者の組織である。さらに、このex vivoでのモデルはまた、単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手順をすることができます。それは、2D環境ではないだけでなく、 生体内環境では真似の3D器官の状態で細胞の挙動を評価することが決定的に重要である。このシステムは 、in vitro 及び ex vivo における単一細胞遊走の3Dトラッキングと組織又は器官培養にカバーガラスベースディッシュを用いた高分解能イメージングを可能にし、viで上に移動する前の中間ステップことができますVOのパラダイム。
プロトコル
1。神経前駆細胞の分離
- E14-16マウスと冷たいDMEM/F12培地の場所から全体の脳を解剖する。 35ミリメートルのペトリ皿に解剖顕微鏡および転送の脳の下にあるすべての髄膜を除去します。
- 機械的に組織の断片に脳を分離し、15 mlのチューブにそれらを転送するために微細な鉗子を使用し、破片を除去するために3分間800rpmでサンプルを遠心します。
- DMEM/F12含むbFGFおよびEGFを追加し、1 mlのピペットでひいて粉にする。
- 単一の細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。
- 2から5×10 4細胞/ mlのフラスコに細胞をプレートしてから、6日毎3日ごとに、通路の細胞を完全培地の変更を実行します。
- 少なくとも5つの継代後、ダイジェストは単一の神経細胞にトリプシンとEDTAを使用してpoly-D-lysine/laminin-coated electrotactic室（2に後述するように調製した）上に成長。 、N2-サプリメントを含む成長培地を使用します。bFGFおよびEGFはすべての回でNPCの特性を維持します。
2。 electrotactic室の準備
- ダイヤモンドペンを使用して半分にオートクレーブ処理22×22ミリメートルNo.1の厚さのカバーを割ってガラスの22....
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ディスカッション
我々が使用するプロトコルは、以前の研究5,11に基づいています。標準化された寸法精度のカスタム設計electrotacticチャンバー内で培養した細胞またはスライスに、寒天橋、Steinberg社のソリューション、及びAg / AgCl電極電極を介してEFを適用しながら、これらのメソッドを使用して、安定した文化や電流条件を維持することができる。チャンバーの深さが異なるサンプルに対応するために調整することができます11の厚さ、細胞の場合には、室の大きさは、しかし多くの細胞を収容するために変更することができます（例えば、ウェスタンブロット分析は、多くの細胞を必要とする）が必要です。我々は単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手続きを可能にするためにこれらのメソッドを変更し、開発してきました。 EFSに対する細胞応答に関する先行研究の大半は、2D環境で実施されています。単一細胞レベルでのNPCのelectrotactic応答の in vivo研究では任意の生理学的関連.......
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開示事項
我々は、開示することは何もありません。
謝辞
この作品は、BSに王立協会URF助成UF051616、英国、欧州研究評議会STG助成金243261によってサポートされていました。 MZラボでの作業は、再生医療助成RB1-01417のカリフォルニア工科大学でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| FGF-基本的な組換えヒト | インビトロジェン | PHG0026 | 20 ng / mLの |
| EGF遺伝子組換えヒト | インビトロジェン | PHG0311 | 20 ng / mLの |
| N2-サプリメント（100X）液体 | インビトロジェン | 02048 | |
| DMEM/F12培地（高グルコース） | インビトロジェン | 31330-095 | |
| ポリ-D-リジン | ミリポア | -003-E | |
| ナチュラルマウスラミニン | インビトロジェン | 23017-015 | |
| 成長因子の減少基底膜マトリックス（マトリゲル） | BDバイオサイエンス | 354230 | |
| HEPES緩衝液 | ギブコ | 15630 | |
| マッキルウェーン組織チョッパー | ミクル研究所エンジニアリングのCo株式会社 | TC752-PD | |
| ダウコーニング高真空用シリコーングリース | Sigma-Aldrich社 | Z273554 |
参考文献
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- B....
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再版と許可
