分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

サマリー

分裂酵母、シゾサッカロマイセスポンベ、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。

要約

いくつかの顕微鏡技術は、細胞内の特定のタンパク質を検出することができる、今日利用可能です。過去10年間の間に直接、目的のタンパク質に接続された緑色蛍光タンパク質（GFP）のような蛍光色素を用いた生細胞のイメージングは^、1人気が高まっています。 GFPと同様の蛍光色素を用いてタンパク質の細胞内ローカライゼーションと動きを蛍光顕微鏡で検出することができます。また、また、染色体の特定の領域の核内局在性は、この手法を用いて研究することができます。 GFPは、Lacリプレッサータンパク質（LacR）に融合させ、異所的lacO配列のタンデムリピートが染色体²上の関心領域に挿入されている細胞内で発現されています。 LacR - GFPは、lacOの繰り返しにバインドされ、ゲノムのその領域は、蛍光顕微鏡で緑色のドットとして表示されます。酵母は、特に相同ので、このタイプの操作に適しています組換えは、非常に効率的であり、それによってlacOを繰り返すとGFP ³人工融合タンパク質の標的を統合することができます。ここでは、分裂酵母の生細胞解析のための定量的な方法を説明します。分裂酵母の生細胞解析のための追加のプロトコルは、減数分裂の染色体の行動の⁴のムービーを作成する方法の例については、見つけることができます。この特定の実験では核内の組織とそれがどのように遺伝子の誘導中に影響を受けているに焦点を当てる。我々は、遺伝子の近傍にlacO結合部位を導入することにより、塩基番号という名前の遺伝子クラスターを、、ラベルを貼っている。遺伝子クラスターは、分裂酵母⁵の窒素飢餓時に早期に誘導される遺伝子を濃縮される。株では核膜（NM）が赤色蛍光シグナルを生じさせるNMタンパク質Cut11にmCherryを接続してラベルが付けられます。紡錘体極体（SPB）化合物Sid4は、赤色蛍光タンパク質（Sid4 - ^MRFP）6に融合させる7に埋め込 ​​まれているSPBに添付されています。 SPBは、NMの大きな丸い構造として識別されます。前の画像と20分窒素源の枯渇後に我々は、遺伝子クラスター（GFP）とNM / SPBの間の距離を決定することができます。窒素の枯渇の前と後の平均値や中央値の距離が比較され、我々は、このように窒素の枯渇後の遺伝子クラスターの細胞内局在の変化があるか否かを定量化することができます。

プロトコル

1。分裂酵母の培養

1. エディンバラ最少培地（EMM）を準備し、塩化アンモニウムのないEMM（EMM - ^N）8。自家蛍光グルコース溶液を減らすためにオートクレーブしてはいけませんが、代わりにフィルタし、その後オートクレーブメディアに追加さ0.2μmのを使用して滅菌フィルター。
2. 新鮮な濾過滅菌グルコースとEMM液体培地3mlに^、8 YEA、リッチメディアと寒天プレート上に成長した分裂酵母の細胞を接種する。軽く細胞の十分な換気を確保するためにキャップをプッシュで13mLチューブを使用してください。細胞は30で225回転でそれらを揺することによって成長しましょう​​℃に適切な希釈、毎朝と夕方に続いてBurkerチャンバーを使用して、それらをカウントすることにより、 - （2 × 10 ⁷細胞/ mLの1 × 10 ^6）2日間細胞は対数増殖期に成長しておいてください。
3. 実験の日に早期対数増殖期、5で細胞を持っていることを確認してくださいX 10 ⁶ - 1 × 10 ⁷細胞/ mLの。
4. tを飢えへEMMメディアからEMM - Nのメディアへの切り替え20分間の間に窒素のための彼の細胞。これは、分裂酵母⁹のストレス応答を誘発する可能性が速い速度での遠心分離のように最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を3mlのを収穫することによって行われます。ダブル紡績技術、意味が使用する、2分間の最初のスピンを、次にエッペンドルフチューブ180 °回転し、1.5 RCF 2分^10秒間再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。 EMM - Nで1回洗浄し、EMM - Nでペレットを溶解し、30℃で15分間細胞をインキュベート℃で225 rpmで振盪し、次に2を指すように続ける。サンプルの準備。

2。サンプルの準備

1. 速い速度で遠心分離などの収穫最大1.5 rcfで、ベンチトップ遠心分離機で1.5mlのエッペンドルフチューブに細胞を1.5 mLのは、分裂酵母⁹のストレス応答を誘発するかもしれない。ダブル紡績技術、meaniを使用NG、2分間の最初のスピンは、その後、エッペンドルフチューブ180 °回転し、2分¹⁰ 1.5 RCFのために再びスピン。これはチューブの底に一つペレット内のすべての細胞を回収するのに役立ちます。
2. 上清を取り除くが、10から15μLを残し、残りのメディアに細胞を懸濁します。また、細胞ペレットを再懸濁させる新鮮な培地の10μLを加える。
3. 透明なガラススライドとカバーガラス（無1.5）を持っていることを確認してください。通常は、それらをクリーンアップする必要がありますが、それらが塵のフルではないことを確認していない。
4. 冷凍庫からフィルター滅菌されています1mg/mLレクチンのストック溶液のアリコートを取り出してください。レクチン溶液は数回再凍結することができます。レクチンは、カバーガラスで酵母細胞を固定するために使用されます。
5. 客観的なガラス上で濾過滅菌グルコースとEMMの代わりに5μL。
6. カバーガラスの隅にあるレクチン溶液5μLを置きます。その後、レクチンドロップで同じコーナー、すなわち、細胞培養の5μLを配置。その後数回ピペッティングしてミックスがピペットの先端の長い側を使用して、カバーガラスを通して細胞培養レクチンミックスを広げる。あなたの細胞混合物の密度に応じてすべてのものを残したり、カバーガラスの反対側の隅にある余分な液体を吸い上げる。
7. 客観的なガラスとベンチで反対側の片側で、上のトップ、カバーガラスを置きます。カバーガラスは、数分間少し乾かします。それは絶対に完全に乾燥させてはならないが、それはあまりにも多くの液体ガラス上であってはならない。
8. EMMのドロップによる客観的なガラスからおおよそ70 °の天使とカバーガラスを置きます。それはEMMのドロップにトップダウン落下するように、カバーガラスを放す。
9. シリコングリースとの縁をシールすると、2 mLの注射器を準備する。 200μlの先端の広い方の端をカットして注射器に添付します。シリコングリスの約1 mLの注射器を埋める。シリコンの微細な線を穏やかに膿がカバーガラスの端に適用されます興注射器のピストン。今、あなたはS.の小さな成長チャンバーを持っている分裂酵母細胞。

3。顕微鏡検査

1. 水銀/キセノンランプ、顕微鏡とコンピュータをオンにして蛍光顕微鏡を初期化する。蛍光顕微鏡で酵母の成長室を置きます。 63 ×対物レンズまたはNA = 1.3以上で100 Xの目標を使用してください。油浸対物が使用されている場合は、オイルを追加。
2. セルを検索し、シャープな画像を得るために明るいフィールドを使用してください。
3. 蛍光顕微鏡の設定は、酵母細胞と顕微鏡を標識するために使用される蛍光色素によって異なります。我々は、16ラインの平均平面スキャン設定とプラン - アポクロマート63x油浸対物レンズ（NA = 1.4）との共焦点顕微鏡ツァイスLSM 700レーザー走査型顕微鏡を使用してください。ピンホールは、0.8 mmの光学的スライスを与える1から1.1エアリーユニット、に設定する必要があります。我々は、このようにD 582 nmのビームスプリッタでアレクサ488用のフィルタセットを使用して、トラック1にGFPを検出488と582 nmの間の波長をetecting。トラック2に我々は、578と600nmの波長を検出するので、578 nmのビームスプリッタを使用してmCherryに最適なフィルターセットを使用してください。これは、トラック2にMRFP（SPB）とNM（mCherry）の両方が検出されることを意味します。
4. 多くの写真がそれぞれの株について60種類の細胞で測定できるように、必要に応じてかかります。通常、独立した顕微鏡の分野の15枚は十分です。それは、顕微鏡の時間が60分を超過した場合、新鮮な細胞を用いた新たな成長チャンバーが行われることをお勧めします。

4。細胞内の距離の定量的測定

1. ツァイス禅ライト版のプログラムで画像を開きます。測定ツールの測定のすべての信号が同じ焦点面内にあるすべてのセルに異なる蛍光色素間程度の距離を使用する。蛍光シグナルの中心を識別するために、光強度とコントラストを調整します。この簡略化されたプロトコルは、2つだけ異なるcを使用していますolours、したがって、SPBとNMは、同じチャネルになります。 SPBは、NMで、その大きな丸い構造によって選び出されます。メモ帳のシートまでの距離を転送する。少なくとも60細胞で測定します。このようなImageJのような他のプログラムにも距離を測定するために使用することができるが、ツァイス禅のライトは、その高い画像の解像度と、そのプログラムを使用してズームインおよびズームアウトする使いやすさのために好ましい。 ImageJの年にオープンLSM形式の画像はお互いの上に二つのチャンネルを持つことになります。両方のチャンネルを持つ画像を作成するには、最初の2つのチャンネルを分割し、その後、それらをマージする。その後ラインツ​​ールは、前述のように距離を測定するために使用することができます。
2. SigmaStat - 3.5ソフトウェアを使用して、例えばt検定またはMann - Whitneyの順位和検定、例えば、統計的なプログラムを使用して、異なる菌株と両群間の平均または中央値細胞内の距離を比較する。短い持つセルの選択があるだろうので、頻繁にデータが正常に配布されていませんすべての信号からの蛍光信号間の距離を測定すると同じ焦点面にある必要があります。マン-ホイットニー順位和検定は、正規分布を欠いているデータセットの比較を可能にしながら、データが正規分布しているときに、t検定にのみ使用できます。マン-ホイットニー順位和検定で中央値が比較されている間t検定では二つの異なるデータセットの平均値が比較されます。

5。代表的な結果

ひずみPJ1185：（H ⁺ his7 ^{+：：dis1placR} - GFP塩基番号[：：ura4 ⁺ hphMX6 lacO] sid4 - MRFP：：kanMX6 cut11 - mCherry：：natMX6 ura4 - D18 leu1 - 32 ade6 - DN / N）が EMMに成長させた。サンプルを取り出し、小さな成長チャンバーと絵に取り付け（図1A + N）採取した。その後、増殖培地は、EMM W / O塩化アンモニウム（EMM - N）に置き換え、そして細胞はgであったれました振盪しながら15分間rown。飢餓状態の細胞をEMM - Nと映像との成長チャンバーにマウントされた窒素は、（図1A - N）を採取した。測定ツールは、遺伝子座（GFP）とSPB（図1Bおよび表1）の間の距離を測定するために使用されていました。さらに、遺伝子座（GFP）とNM間の距離は、（図1Bおよび表2）を測定した。窒素の枯渇の前と後の中央値は細胞内の距離は、SigmaStat - 3.5ソフトウェア（表3）を用いて比較した。 SBPに向かってNMから離れて移動する遺伝子クラスターの局在において統計的に有意な変化があった。 GFPとSBPの間の距離を測定するデータはt -検定（表1と3）を使って比較できるので、正規分布と平均距離（1.777μmの+ Nと1587μmの- N）を有していた。 2つの平均値（P = 0.008、t検定）との間に有意差があった。 GFPとNM間の距離を測定するデータは、通常のディを持っていなかったstribution従って中央値の距離は（0μmの+ Nおよび0.390μmの- N）のMann - Whitney順位和検定（表2および3）を用いて比較した。 two中央値（P <0.001、Mann - Whitneyの順位和検定）との間に有意差があった。

図1 GFPでマークされた塩基番号という名前の遺伝子のクラスターの局在は、窒素飢餓後に変更。 （A）左列、+ N、EMM右側の列で育った細胞、- N、EMM - Nに生育細胞から代表的な細胞核からの代表的な細胞核。グリーンが塩基番号クラスタのラベル付けGFPのシグナルである、赤はそれぞれ、SPBとNMをラベリングMRFPとmCherryです。 （B）同一細胞の核として（A）が、現在測定された核内の距離で、黄色：細胞核の直径は、青色：SPBとGFPシグナルとピンクの間の距離：GFPのシグナルと核膜の間の距離。

表1。EMMで育ったPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。

表2。EMM - Nで栽培さPJ1185ひずみの程度で測定された核内の距離。最初の行、セルの直径（D）、2行目、GFPとSPB、3行目の間の距離、GFPとNM間の距離。

表3。歪みPJ1185で観測された核内の距離の記述統計量の窒素飢餓の前に（+ N）と（- N）の後。最初の行：測定されたセルの数、2行目：平均直径（D）、3行目：中位径（D）、など行：GFPとSPB、番目の行の間の距離を意味する：GFPとNMとの間の中央値の距離。

ディスカッション

過去10年間中に携帯電話のイベントを監視するための生細胞イメージングの使用は、ますます人気となっている。それはクラゲオワンクラゲから緑色蛍光タンパク質の使用を開始し、現在多くの異なる蛍光色素は、シアン（475 nm）から遠赤（648 nm）を¹¹に幅広いスペクトルを介して発光蛍光ご利用いただけます。免疫上の生細胞イメージングの大きな利点の一つは、細胞がそれ故に固定のプロセスから可能なアーチファクトを避けること、顕微鏡の前にホルムアルデヒドやエタノール/アセトン処理により固定されていないということです。さらに、生細胞イメージングでは、個々のセルを追跡し、携帯電話のイベント¹²の動画を取得することが可能となり、インキュベーションの数時間または数日中に頻繁な間隔で写真を撮るために可能性を提供しています。哺乳動物細胞は、約3〜4＆の直径を小さく酵母細胞に比べ、約100μmの直径で、大きいサイズを有するという利点を持っているムー、M.一方、酵母の利点は、操作が簡単なゲノムである。相同組換えが酵母で非常に効率的に発生し、異なる蛍光色素³に目的のタンパク質を融合するために使用されます。また、lacOシーケンスとLacR - GFPタンパク質のその後の発現の標的との統合を使用すると、細胞核²内のゲノムの特定の部分の検出を可能にする。 S.の使い方彼らは低コストの細胞の培養条件での高速生成時間とともに成長する自然な単細胞生物なので、顕微鏡での分裂酵母細胞は、追加の利点があります。また、S.分裂酵母は、後生動物の相同遺伝子を持っているので、優れた真核生物のモデル生物です。

この手法の主要な限界の一つは、真の信号の検出を妨害する酵母細胞における自家蛍光である。この問題は、代わりにオートクレーブのフィルター滅菌グルコースと最小限の増殖培地を使用することで解決できます。のさらに、酵母細胞は、それらをマウントする前に、ログフェーズで2日間増殖されるべきである。ここで紹介するプロトコルは、酵母細胞内のタンパク質の細胞内局在を決定するために比較的単純な、まだ定量的な方法を提供しています。また、異なる時点で写真を撮ることによって我々は携帯電話のイベントを続けることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬/装置の名前	会社	カタログ番号	コメント
レクチン	シグマ	L1395
シリコングリース	ダウコーニング
レーザー走査顕微鏡 LSM 700	ツァイス	LSM 700	他の共焦点顕微鏡を使用することができる。
SigmaStat 3.5	Statcon	SigmaStat 3.5	統計分析のための任意のソフトウェアを使用することができる。