E13マウスからグリア制限前駆体の導出

サマリー

このプロトコルは、胎児の脊髄からグリア制限前駆体の導出の概要を説明し、移植またはオリゴデンドロサイト系譜の研究のいずれかをin vitroで維持されます。

要約

これは、E13のマウス胎児の脊髄から神経膠限定前駆（GRP）細胞の誘導するためのプロトコルです。これらの細胞は、オリゴデンドロサイト細胞系譜内で早期の前駆体である。最近では、これらの細胞は、白質疾患の修復治療の潜在的な源として研究されている。脳室周囲白質軟化症（PVL）は、小児期に非遺伝白質疾患の主要な原因であると非常に未熟児の50％まで影響を与えます。データは、低酸素虚血脳の発達、酸化ストレスと選択的に初期の白質を標的と興奮の高まり感受性を示唆している。グリア制限された前駆体（GRP）、オリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）と未熟なオリゴデンドロサイト（preOL）はPVLの開発におけるキープレーヤーであるように見えると継続的な研究の対象となります。さらに、先行研究として興奮をグルタミン酸に対する感受性を増加しているCNS組織のサブセットを同定したこの感受性の発達パターンも。当研究室では、現在開発中のGRPの段階でPVLと使用細胞のオリゴデンドロサイト前駆細胞の役割を調査しています。我々は、PVLと一貫性の応力を選択するには、それらの応答をテストするためにいくつかの実験パラダイムでこれらの派生したGRP細胞を利用しています。 GRP細胞は、マウスPVLモデルとし、低酸素虚血を含むPVLのような侮辱のin vitroモデルの移植実験のためにOPCのとpreOLにin vitroで操作することができます。培養細胞を使用し、in vitro試験データの解釈を容易に実験間のばらつきが存在削減されるだろう。非GRP表現型の細胞の混入の影響を最小限に抑えながら、培養細胞はまた、GRP人口の濃縮が可能になります。

プロトコル

はじめに

このプロトコルでは、E13のマウス胎児の脊髄から神経膠限定前駆（GRP）細胞を抽出選択して、プレートする方法を示しています。これらの細胞はオリゴデンドロサイトとアストロサイトの細胞系譜内で早期の前駆体であるとA2B5のそれらの式で定義されています。 FGF-2を添加したGRP媒体において、A2B5 +ののGRPは、初期オリゴデンドロサイト系譜マーカーPDGFαRとNG2 ^1,2を表現^し始めます。これらのオリゴデンドロサイト系譜の細胞は、異なる表現型の段階では、形態学的変化と同様に、特定の発達段階へのマーカーの発現によって特徴付けられるそれらの各々のシリーズを通過します。

これらの前駆細胞は、現在、多発性硬化症、leukodystrophiesと脳室周囲白質軟化症^{（PVL）3,4,5,6}を含む中枢神経系白質の疾患の細胞ベースの治療的アプローチの潜在的な源として研究されている6,7,8,9に成功した再ミエリン化を報告しています。これらのグリア前駆細胞は、脊髄損傷や筋萎縮性側索硬化症^10,11,12,13のような他の白質疾患モデルの研究にも使用されている。

当研究室では、我々はPVLの回復のアプローチは、脳性麻痺^14,15,16の主要な原因として、GRP細胞由来のこれらの脊髄の有効性を評価されていると出生後早期低酸素虚血マウスモデルを開発しました。広くGRP細胞は星状膠細胞の経路¹⁷に分化する傾向があるので、白質の損傷を研究するために使用されている齧歯類の脳由来のOPCモデルもあります。 OPCの表現は、すでにオリゴデンドロサイト系譜経路、irreve思われる現象に入っているrsible。しかし、我々は、GRPと可能性もE10.5で派生したNEPは含むオリゴデンドロサイト前駆細胞の広いスペクトルの応答を評価する上で興味を持っています。この理由のために我々の仕事のための脊髄由来のGRPモデルを採用しています。

電池交換のためのGRPの使用に加えて、野生型および白質疾患のトランスジェニックげっ歯類のモデルから、これらの細胞の誘導は、in vitroでの設定で正常と病気の条件下でグリアの分化にさらなる研究が可能になります。以前の資料は、成熟依存性グルタミン酸興奮毒性、酸化ストレス、および神経炎症^18,19に関与して選択の要因のような様々な外部ストレスにオリゴデンドロサイト系統前駆細胞の選択的脆弱性の証拠を示しています。我々の研究で細胞の感受性を評価し、これらの白質損傷の発展の背後にある細胞および分子メカニズムを理解することに焦点を当てているオリゴデンドロサイト系譜スペクトルが推定される治療的アプローチを分析するだけでなく、侮辱する。

材料

動物を含むすべての手順は、PHS政策とJHU IACUCに準拠しています。すべての手順は、無菌状態を維持するために、層流フードで実行する必要があります。一般的に解剖は水平流フード内および垂直流フードの in vitro の作業で実行されます。すべてのメディアは、解剖時に風邪を使用。我々の研究で使用されているマウスは、野生型CD-1株およびC57/BL6バックグラウンドでトランスジェニックGFPである。 One CD-1マウスのダムは通常、種子1月2日T25フラスコに十分である10 +の胎児が得られます。通常は、2つのダムは、一度に犠牲にし、胎児の脊髄をプールし、ダムごとに1 T25フラスコに播種されています。一度細胞は、それらが拡大し、その後の研究のためにin vitroで特徴づけることができる派生されています。

1。メディアとフラスコの調製

• GRP株式、N2（100、Invitrogen）を補足およびウシ血清アルブミン（BSA、0.5％w / v）のDMEM / F12 1:1（Invitrogen社製）+ B27（インビトロジェン社製50倍）：媒体が解剖媒体として使用されています。
• 解離培地：解剖媒体と同じです。
• 培地：GRP在庫培地+ FGF-2（10-20 ng / mlで、Invitrogen社）とヘパリン（1μg/ mlを、Sigma社製）。
• PLL /ラミニンコーティングされた75センチメートル²または25cm ^2のフラスコ（T75またはT25）。
• その後吸引1時間37℃でインキュベートした蒸留H ₂ Oに;組織培養フラスコ（75 cm ^2と 、ファルコン）が15-20μg/mlポリ-L-リジン（シグマPLL）で被覆した。フラスコは細胞がメッキになる準備が整うまで、15から20μg/ mlで37℃、PBS中のラミニン（シグマ）で1時間C、その後吸引し、新鮮なPBSまたはメディアが追加されたコーティングされた後、PBSで1X洗浄する。コー​​ティング後、フラスコを乾燥した許可すべきではないが、4時にPBSまたはメディアに保管することができ°使用前に短時間のためのC。

2。楽器やその他のMaterial

• ペトリ皿：ダムあたり4：解剖（75 mm）の3シャーレ、収穫脊髄を収集するために20 mmのディッシュ。
• ダムの腹部を開くための大鋏（43 mm動作はさみ、Roboz）および組織鉗子。
• 子宮を解剖して胎児（15ミリメートルマイクロ解剖はさみ、Roboz）を除去するための小さなはさみ。
• ミクロ解剖春のはさみ（6 mm）は胎児の脊髄を分析します。
• Microは、手術中にダムと胎児の体を固定し、後で一回露出した脊髄を除去するための角度の鉗子を解剖。
• メッキの前に細胞残屑を除去するための40または70マイクロメートルのセルストレーナー。
• 0.05％トリプシンで37℃に温めた
• 100xの株式（1グラム/ ml）として準備し10 mg / mlのDNアーゼ1（Sigma）を、。
• 動物の死体のためのバイオハザードバッグ。
• 処理のために15〜50 mlの遠心管は脊髄を抽出​​した。

3。時限Prを決定するegnancy

妊娠マウスダムのいずれかの胚の日に社内で決定した胎児の発育や妊娠のE12またはE13の配信を指定して、商業的供給源から購入されています。簡単に言うと、女性2人は午後遅くに1つの男性と一緒に配置され、一緒に一晩放置。次の日は、女性は膣に位置して粘液のプラグインの有無を観察しています。粘液のプラグは、動物が続いて体重増加率を監視するために毎日計量されるように交配が発生したことを唯一の指標である。粘液栓が観察される日は、胚の初日（E1）として定義されています。

4。組織の導出

1. 無菌状態を維持するために水平流フードの下で働く。
2. 70％エタノールでフードと作業領域を下にスプレーします。
3. オートクレーブ楽器や70％エタノールで自由にスプレー。
4. 楽器、メディア、および使用するために顕微鏡を準備します。
5. 滅菌したペトリディに冷たい解剖培地20mlを注ぐshを。
6. 頸椎脱臼または断頭続いて抱水クロラールと動物（500 mg / kg）を腹腔内投与（IP）を麻酔。
7. 70〜90％エタノール（消毒）とダムの腹部をスプレー
8. 大きなハサミとピンセットで腹部を開きます。
   1. CD1とC57/BL6系統で通常8から14胎児は子宮の内側になります。胎児の数はひずみに依存しています。
9. 胎児の血液と組織の破片を洗浄するためのクリーンペトリ皿の中で新鮮な冷たい解剖培地中の子犬と場所を含むマウスの子宮を抽出します。
10. 子宮角から各胎児を抽出し、小さなハサミを用いて胚嚢および胎盤からそれらを分離します。新しいペトリ皿に新鮮な郭清を培地に抽出した胎児を転送します。
    1. 解剖媒体は、代謝活性を低下させ、派生した細胞の生存を維持するために低温である必要があります。
    2. 2鉗子で今から作業し、マイクロは、SPring-はさみを解剖。
11. 解剖顕微鏡下で働いて、マイクロ手術用ハサミと脊髄を露出する背面剥離皮膚と脊髄に沿って皮膚を切った。
12. C1約尾の冒頭で、顕微はさみで脊髄をトランセクト。
13. 、無愛想なピンセットで脊髄を削除し、すべての骨や軟骨が取り除かれていることを確認し、培地を解剖の第³のペトリ皿に移します。
14. その後の培養細胞における髄膜組織の増殖を防ぐためには、脊髄から可能な限り髄膜の限りを削除しようとする。新生突き出た末梢神経のために、この抽出された大脳から髄膜組織を除去するよりも難しい。
15. 一度髄膜が除去された、20ミリメートルのペトリ皿に脊髄を転送
16. 徹底的に70〜90％エタノールで領域を噴霧することによってクリーンアップします。
17. 解離のために、次の手順を維持するために迅速に行われるべき派生した脊髄組織の高い生存率。

5。文化の確立

1. トリプシンは37°CH ₂ O-お風呂で少なくとも30分間プレ温めなければなりません。適当なアリコートは、温度変動に対する在庫のリスクを軽減するために在庫から削除する必要があります。
2. 10ミリリットル予め温めておいたトリプシン（0.05％品質バイオ）を含む50mlの遠心管に採取し脊髄を転送し、100μlのDNaseを（10 mg / ml）と簡単に粉薬。
3. 37インキュベート℃で10分間CH ₂ O-お風呂に。
4. 粉薬と別の10分間インキュベートする。
5. 5ミリリットルGRP培地（上記で定義）と、1000 RPMで5分間遠心分離を追加します。
6. 10ミリリットルGRP媒体と上清を吸引し、ペレットを再懸濁しとDNase-1（10 mg / mlと、シグマ）を追加します。
7. 37インキュベート℃で10分間CH ₂ O-お風呂に。
8. 1000 RPMで5分間遠心し、上清を吸引除去する。
9. 周波数でペレットを再懸濁しその後SH GRP媒体40とフィルターの破片 - 70μmのセルストレーナー。
10. PLL /ラミニンコーティングした25cm ^2のフラスコ（T25）と37℃、湿度95％および5％CO ₂のプレート。
11. 100％のメディアには、次の日に変更します。
12. この時点で、のGRPは、接続されているとプロセスを拡張し始めました。

6。 GRPの人口Immunopanning

1. フラスコまでのPLL /ラミニンコーティングしたフラスコ内のプレート脊髄組織は85から90パーセントコンフルエントまたは週間程度です。
2. 3ミリリットルGRP媒体と収穫ラバーポリスマンを用いて、または0.05％トリプシンでフラスコをこすることによって細胞を、徹底的にでも優しく粉薬、5分間1000rpmで遠心分離し、徹底的にペレットを再懸濁します。
3. 1 T75フラスコに3 T25フラスコまたは3 mlに各1 mlを移し、細胞を完全にカバーし、フラスコを80〜90％コンフルエントに到達できるようにする媒体の適切なボリュームを追加します。
4. 早くメディアがすぐに枯渇させる場合には、一日おきにメディアを変更します。
5. コー​​ト細菌のPe一晩4トライ料理（75ミリメートル）°抗マウスIgM抗体（サザンバイオテック）とC、PBSで10μg/ mlの。
6. 過剰なバッファーを吸引除去し、PBSで3倍のペトリ皿を洗う。
7. 室温で1時間（RT）のPBSとインキュベートで希釈した5μg/ mlの濃度でA2B5抗体（ミリポア社製）を追加します。
8. 再度PBSで3倍板を洗うには、プレートの乾燥を防ぐために、GRP培地8mlを追加します。
9. すべてのセルを切り離すことでラバーポリスマンを用いてフラスコをこすることでペトリ皿と収穫GRP細胞からGRPの培地5mlを転送
10. 塊を分割し、A2B5コーティングされた細菌のペトリ皿に5ミリリットル細胞懸濁液を転送するために一時的に細胞懸濁液をひいて粉にする。
11. 振とうせずに室温で1時間インキュベートします。
12. PBSで8倍速の後に1時間吸引メディアや洗濯板。
13. 静かにしてGRP媒体の適切なボリュームでPLL /ラミニンでコートしたプレートまたはフラスコに移す2ミリリットルGRPメディアでラバーポリスマンで細胞をこすり取る。

7。由来細胞の凍結とストレージ

1. 細胞を2mlの0.05％トリプシンで85から90パーセントコンフルエントT25またはT75フラスコから収穫されています。
2. トリプシンを希釈し、不活化8ミリリットルGRP在庫培地で、5分間1000rpmで遠心分離されています。
3. T25フラスコからペレットを1mlのGRPの凍結媒体（GRP在庫培地は10％（v / v）のDMSOおよび必要に応じ、20％FBSを添加）に再懸濁しています。 T75フラスコから大きなペレットを2倍に希釈されています。
4. 1.5細胞懸濁液- 3×10 ^10,11,12,13細胞は、℃で一晩ゆっくり凍結する低温バイアル（ナルゲン）に移し、-80℃でイソプロパノールを含む低温容器（ナルゲン）で一晩保存されています。
5. 一晩凍結細胞は、次は_N（l）に°Cまたは長期の冷凍ボックスに転送され、-80℃で1年に6ヶ月間保存されています。解凍した細胞は、通常、PLL /ラミニンコーティングの品質に大きく依存して実行可能な60から80パーセントです。
8。代表的な結果

CO _2があるため、最終的に胎児由来の細胞の生存可能下流効果の動物の麻酔に使用されません。さらに、それは完全に導出手順の間に脊髄から髄膜を除去するために非常に困難になりますが、GRP媒体とimmunopanningの組み合わせは、これらの急速に成長して細胞を除去します。同様に、全体の脊髄は、その腹側脊髄に起因すると背側²⁰への移行のためにGRPの人口の大きな腹濃度にもかかわらず、収穫される。しかし、GRP媒体はGRP表現型に選択し、その人口はA2B5 immunopanningによって最大化されます。脊髄組織をめっきした後、in vitroでの培養は2継代または週約インキュベートされる。文化の中で2日後、別の形態の細胞がヘテロを示す組織培養フラスコ内で観察することができます人口のgeneityしかしGRP媒体はGRPの表現型を選択します。これらの細胞は、A2B5 + GRP、E-NCAM +神経制限前駆体（​​NRP）およびネスチン+、A2B5-神経上皮細胞、おそらくフィブロネクチン+髄膜細胞の組み合わせです。加えて、より成熟した表現型が開始異種プール（ 図1A）から非常にGRP濃縮人口を最大化するためにdoublecortinと神経系統のためにTuj1、アストロサイトのためにGFAP、オリゴ系統用PDGFaRとGalCを含む本を発現するマーカーかもしれないが、細胞ができる細胞密度は、T75フラスコでコンフルエントに85から90％程度に増加していたら、A2B5の選択に続いてE-NCAM +細胞+ GRPの人口を選択して排除するダブルimmunopannedある。これらのGRP細胞は、その後のA2B5 immunopanningは、高濃縮GRPの人口を維持するために必要があるかもしれませんので、オリゴデンドロサイト表現型を選択して培地中にいるにもかかわらず、アストロサイトになるための能力を維持します。 Immunopanning GENER最大95％A2B5 +細胞が、さらに大きな収量A2B5共役磁気ビーズ（Miltenyi Biotec社製）に味方の収率は97％までの収率を提供するために使用することができます。定期的なメディアの変更などのメンテナンスGRPの文化では警戒が非GRPの細胞型の増殖を最小限に抑えることができます。さらにBMP-4の存在下でアストロサイトがまだ発見し、枯渇することができ、特にメディアは、星状膠細胞表現型への分化を誘導すると思われる。 B27サプリメントは、トリヨードチロニン-ホルモン（T3）が含まれていますが、この現象が発生したT3の高いレベルを培地に添加されている場合にのみ、GRPの人口のオリゴデンドロサイトに分化する傾向が観測されたがありませんでした。成熟したオリゴデンドロサイト（ 図1B）による汚染の懸念がある場合は、T3フリーB27サプリメントは、置換することができます。これらのGRP細胞は容易に2つまたは3つの短いプロセスと小さなソーマの彼らの形態ではなく、存在するかもしれない他の細胞型の画面に識別することができ、IMmunocytochemistryは、以前にその名前の一般的な発達と細胞タイプ特異的なマーカーのために実行することができます。一般に神経（NEP）とGRPまたはNRPのどちらかになることが可能であるA2B5細胞の小さな永続的な人口があるでしょう。幸いなことに、長い細胞を培地GRPの表現型を選択する可能性が高いGRP培地中で維持されます。



図1）。異種の形態のめっき脊髄細胞は、培養2日後に観察される。b）の Immunopanningが開始異種プールから非常にGRP-濃縮人口を最大化します。

ディスカッション

障害は、遺伝的炎症、虚血性および毒性の原因を含む病因の多数を含む ^{19,21,22,23,24}。多発性硬化症とvasculopathiesは、成人の白質疾患の主要原因であるが、未熟児に関連付けられている脳室周囲白質軟化症は、小児集団における白質損傷の最も一般的な原因です。さらに大幅に周産期の侮辱の影響を受けている細胞ofoligodendrocytic系統の病気のメカニズムをさらに研究を線引きするために、必要とされる。のGRPは、げっ歯類の胚の脊髄から単離され、自然の中でtripotentialであることが示され、オリゴデンドロサイトとアストロサイトの二つの異なる集団を生じさせるが、ニューロンに分化していないた ^2,25,26。同様に、ラット視神経および後期胚または早期の生後ラット脳由来のオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）は、適切なメディアの状況で機能するオリゴデンドロサイトに成熟することが実証されています ^27,28さらに、胎児または成体由来のヒトOPCはより一層成熟したオリゴデンドロサイト表現型に操作されている ^29,30。

GRP細胞はE13.5ラットおよびマウスのE12-13.5の脊髄の両方から分離されている。ラットの違いに腹由来のGRPは、より成熟した表現型に分化するように大きい傾向を示すとオリゴデンドロサイト、またはアストロサイトの生成を促進する条件への応答で背と腹から派生したGRP細胞との間で報告されている ^25,26,28。これは、分化の手がかりが少ない受け入れることができる新生GRP細胞の背腹側への移行が原因である可能性があります。 Immunopanningを単離し、培養中のメンテナンスのために収集されるA2B5を表現する集団を可能にします。

私たちのマウスGRPの文化は、GRP細胞は化学物質（媒体）と抗体ベースの手法で選択され、そこから細胞の異種、プールされた人口をもたらし、総脊髄組織から派生しています。我々の研究は、脊髄由来のマウスGRP細胞を利用しているが、それが最近ではまた、成熟オリゴデンドロサイトへと発展が可能である脳由来のマウスオリゴデンドロサイト前駆細胞の誘導が報告されている ³¹。ここから派生した細胞は、最初に適切な培地を使用して濃縮PDGFαR+、OPCの人口に操作されていることをoligospheresとして培養される ³¹。我々の研究は、A2B5 +、PDGFαR-GRPの前駆体から（MBP +）成熟オリゴデンドロサイトに発現しているミエリン塩基性タンパク質へのオリゴデンドロサイト系譜スペクトルの細胞の低酸素性虚血発作の我々のモデルの効果に焦点を当てている。確かに私たちの in vitroで特性は、モノカルチャーや皮質ニューロンの共培養のいずれかMBP発現する細胞にこれらの未熟GRP細胞の成熟を示している。これらの細胞は、周産期の白質損傷に関与するメカニズムを研究するための特定の分化経路に文化の中で操作することができます。オリゴデンドロサイト系譜と、この集団の可用性の細胞を含む白質疾患のいくつかのマウスモデルがあります可能な細胞療法のオプションの有用性を探索するだけでなく、けがの原因となるメカニズムに徹底的な調査が可能になります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号
DMEM / F12午前1時01分	インビトロジェン	11320033
B27	インビトロジェン	17504044
N2	インビトロジェン	17502048
RH-FGF-基本	インビトロジェン	PHG0026
トリプシン（0.05％）EDTA	質生物学株式会社	118-087-721
ポリ-L-リジン臭化水素	シグマ	P1274-25mgを
ラミニン	シグマ	L2020-1mgの
DNase処理1	シグマ	DN25