我々のプロトコルは、ホームセンターで購入インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット、そして安価な材料をリサイクルして、一度に複数のタンパク質ゲルを注ぐ方法を示しています。この経済的かつ合理化された方法は、数週間のために4℃でゲルを保存する方法が含まれています。市販のゲル、頻繁な蛋白質のゲルを実行ラボからプラスチック製のゲルカセットを再利用することで大幅にコストを節約し、環境を助けることができます。
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この記事について
サマリー
要約
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析を用いたタンパク質の評価は、生化学や分子生物学の研究者が1から4で使用される一般的な手法です。タンパク質の毎日の分析を行う研究室では、市販のポリアクリルアミドゲル（〜$ 10/gel）のコストは、時間の経過とともにかなりのことができます。このコストを軽減するために、いくつかの研究者が独自のポリアクリルアミドゲルを準備します。これらのゲルを注ぐの伝統的な方法は、通常、特殊な装置で高価になると多くのゲルを注ぎ、将来の使用のためにそれらを格納し排除することができるガラスゲルプレートを利用しています。また、クリーニングや注入ゲル中のガラスプレートの処理は、学部研究室の授業での使用を排除することが安全上の問題を作成、偶発的破損が発生することがあります。我々のプロトコルは、Invitrogen Nupage NOVEXミニゲルカセットをリサイクルして、同時に複数の蛋白質ゲルを注ぐ方法を示していますし、安価なミリアンペアterialsは、ホームセンターで購入。この経済的かつ合理化された方法は、数週間のために4℃でゲルを保存する方法が含まれています。市販のゲル、頻繁な蛋白質のゲルを実行ラボからプラスチック製のゲルカセットを再利用することで大幅にコストを節約し、環境を助けることができます。さらに、プラスチック製のゲルカセットは、学部研究室の教室のために理想的破損、非常に耐性があります。
プロトコル
1。カセットの準備
- クリーン前面と背面に使用インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット、またはその他の商業ミニゲルカセットのプレート。
- プラスチックエポキシの約1-3 mlを準備し、製造元の指示に従って、よく混ぜます。
- カセットがアセンブルされたときに2つのプレートが接触する前面板の内側にエポキシ樹脂を適用します。
- 開口部を封止するから余分なエポキシを防ぐために、カセットを組み立てるときにバックプレートの下にスリットを通過フィルタ紙や段ボールの部分をスライドさせます。とすぐに二つのプレートが組み立てられるようにろ紙を削除します。
- 密封のためのエッジに沿ってバインダークリップを配置し、カセットが完全に硬化するエポキシ樹脂のために一晩放置。
- 電気テープとバックプレートの底部にスリットを密封する。
2。分離ゲルを注ぐ
- 125mlのサイドアームフラスコに、次の行を追加します。4Xトリス·ベース分離ゲル緩衝液8.70、30.8％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの3.50ミリリットルの2.25ミリリットル、9ミリリットルの合計ボリュームのタイプI試薬グレード水（IRG-H 2 O）の3.25ミリリットル。
- 脱ガス、真空装置にフラスコのサイドアームを取り付け、フラスコの上に反転したストッパーを....
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ディスカッション
タンパク質のゲル電気泳動は、ほとんどの分子生物学研究所のために不可欠な方法です。市販のミニゲルでは、利便性の高いレベルを提供していますが、コストがかかる場合があります。ここでは、市販のミニゲルの人気ブランドからミニゲルカセットを再利用する方法を示しています。このメソッドは、ゲルの既製のソースを持つことの利便性を保持しますが、市販のミニゲルの数分の一のコストで。この手順の重要なステップは、完全に漏れを防ぐために、未重合のアクリルアミドを追加する前にカセットを密封するためのエポキシ樹脂の正しい量を適用している。プラスチック製の定格されている場合にのみエポキシを使用し、製造元の指示に従って、エポキシの重合のための十分な時間を許可します。追加された利便性のために、複数のカセットは、前のゲルを注入して密封して保存することができます。分離ゲルを注ぐとき、tの高さよりも典型的には約0.5センチメートルより、スタッキングゲル用に十分な余地を残すようにしてください井戸を形成するために使用される彼は櫛。分離ゲルの重合時に、バッファ飽和1 - ブタノールは、分離ゲルの上に形成するために、まっすぐ、平らな表面を形成することをゲルが直立のように保つ。ゲルは30.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
著者らは、AHに生命賞のUF科学ハワードヒューズ医学研究所に感謝
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット（1.0ミリメートル） | インビトロジェン | NC2010 | 2、5、10、12、15、2次元の井戸で利用可能 |
| プラスチックエポキシ | ロックタイト | 108771 | |
| 電気テープ | スコットランドの | ||
| 125mlのサイドアームフラスコ | パイレックス | 5360 | |
| 4Xトリス·ベース分離ゲルバッファー | 1.5 M Tris塩基のpH 8.7 | ||
| アクリルアミド | フィッシャー·サイエンティフィック | 01065-500 | |
| ビスアクリルアミド | MPバイオメディカル株式会社 | 800173 | |
| 30.8％アクリルアミド溶液 | 30:0.8アクリルアミド：ビスアクリルアミドIRG-H 2 Oで | ||
| 10％のAPS | フィッシャー·サイエンティフィック | BP179-25 | 使用直前に調製した1ミリリットルIRG-H 2 O、0.1 gの過硫酸アンモニウム |
| TEMED | アルコスオーガニック | 138450500 | |
| 1X分離ゲル用緩衝液で飽和1 - ブタノール | 午前5時02分1X分離ゲルバッファーに1 - ブタノール | ||
| 4X Tris塩基スタッキングゲルバッファー | 1.5 M Tris塩基のpH 6.8 | ||
| ゲルの櫛 | インビトロジェン | NC3015 | 15よく、1.0 mm厚 |
| インパルスシーラー | TEW電気暖房機器 | ||
| ヒートシール可能なポーチ | Kapak / Scotchpak | 1パイントサイズ（6.5 "×8"） | |
| ゲル格納バッファ | 0.1％アジ化ナトリウムを含む1Xスタッキングゲルバッファー | ||
| NOVEX SDSトリス - グリシンサンプルバッファー（2X） | インビトロジェン | LC2676 | |
| DTT | FisherBiotech | BP172-5 | |
| 10XトリスGylcineランニングバッファー | インビトロジェン | LC2675 | 10X株式の1L：29.0グラムのトリスベース、144.0グラムグリシン、10.0グラムSDS |
| X細胞SureLockミニ細胞 | インビトロジェン | EI0001 | |
| ゲルナイフ | インビトロジェン | EI9010 | |
| ステインSimplyBlue安全 | インビトロジェン | LC6065 |
参考文献
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
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