我々のプロトコルは、ホームセンターで購入インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット、そして安価な材料をリサイクルして、一度に複数のタンパク質ゲルを注ぐ方法を示しています。この経済的かつ合理化された方法は、数週間のために4℃でゲルを保存する方法が含まれています。市販のゲル、頻繁な蛋白質のゲルを実行ラボからプラスチック製のゲルカセットを再利用することで大幅にコストを節約し、環境を助けることができます。
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この記事について
サマリー
要約
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）分析を用いたタンパク質の評価は、生化学や分子生物学の研究者が1から4で使用される一般的な手法です。タンパク質の毎日の分析を行う研究室では、市販のポリアクリルアミドゲル（〜$ 10/gel）のコストは、時間の経過とともにかなりのことができます。このコストを軽減するために、いくつかの研究者が独自のポリアクリルアミドゲルを準備します。これらのゲルを注ぐの伝統的な方法は、通常、特殊な装置で高価になると多くのゲルを注ぎ、将来の使用のためにそれらを格納し排除することができるガラスゲルプレートを利用しています。また、クリーニングや注入ゲル中のガラスプレートの処理は、学部研究室の授業での使用を排除することが安全上の問題を作成、偶発的破損が発生することがあります。我々のプロトコルは、Invitrogen Nupage NOVEXミニゲルカセットをリサイクルして、同時に複数の蛋白質ゲルを注ぐ方法を示していますし、安価なミリアンペアterialsは、ホームセンターで購入。この経済的かつ合理化された方法は、数週間のために4℃でゲルを保存する方法が含まれています。市販のゲル、頻繁な蛋白質のゲルを実行ラボからプラスチック製のゲルカセットを再利用することで大幅にコストを節約し、環境を助けることができます。さらに、プラスチック製のゲルカセットは、学部研究室の教室のために理想的破損、非常に耐性があります。
プロトコル
1。カセットの準備
- クリーン前面と背面に使用インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット、またはその他の商業ミニゲルカセットのプレート。
- プラスチックエポキシの約1-3 mlを準備し、製造元の指示に従って、よく混ぜます。
- カセットがアセンブルされたときに2つのプレートが接触する前面板の内側にエポキシ樹脂を適用します。
- 開口部を封止するから余分なエポキシを防ぐために、カセットを組み立てるときにバックプレートの下にスリットを通過フィルタ紙や段ボールの部分をスライドさせます。とすぐに二つのプレートが組み立てられるようにろ紙を削除します。
- 密封のためのエッジに沿ってバインダークリップを配置し、カセットが完全に硬化するエポキシ樹脂のために一晩放置。
- 電気テープとバックプレートの底部にスリットを密封する。
2。分離ゲルを注ぐ
- 125mlのサイドアームフラスコに、次の行を追加します。4Xトリス·ベース分離ゲル緩衝液8.70、30.8％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの3.50ミリリットルの2.25ミリリットル、9ミリリットルの合計ボリュームのタイプI試薬グレード水（IRG-H 2 O）の3.25ミリリットル。
- 脱ガス、真空装置にフラスコのサイドアームを取り付け、フラスコの上に反転したストッパーを配置することによって、10分間のソリューションを提供します。
- 50ミリリットル使い捨てのポリプロピレン製遠心管に脱ガス処刑され、ソリューションの9ミリリットルを転送し、30 10％のammounium過硫酸アンモニウム（APS）の添加およびNμlの6、N、N '、N'、 - テトラメチルエチレンジアミン（TEMED）とミックスを追加する気泡を導入することを避けるためのソリューションを渦巻くによっても。
- すぐにそれはゲルプレートの間に形成される任意のバブルを防ぐために、カセットの側面を下に実行することができ、カセットに溶液を注ぐ。フロント（短い）プレートの上端から約2 cmにカセットを入れます。
- 優しく1X分離ゲル用緩衝液で飽和1 - ブタノール0.5mlを追加し、ゲルが1の重合せ時間。
3。スタッキングゲルを注ぐ
- 4X Tris塩基スタッキングゲル緩衝液pH 6.80、30.8％アクリルアミド/ビスアクリルアミドの0.40ミリリットル、3ミリリットルの合計ボリュームのIRG-H 2 Oの1.85ミリリットルの0.75ミリリットル：125 mlのサイドアームフラスコに以下を追加します。
- 脱ガス、ステップ2で説明したように10分間のソリューションを提供します。
- スタッキングゲル溶液は脱気されていますが、分離ゲルの上端から1X分離ゲル用緩衝液で飽和1 - ブタノールをオフに注ぐ。 IRG-H 2 Oで一回分離ゲルの上部をすすぐ水を注ぎ、残りの液体を吸収する吸湿性またはワットマンろ紙を使用しています。
- あなたの脱気した溶液3mlを削除し、10％APSとTEMED 2μlの9μlを加え、よく混ぜる。
- 迅速に、より短いフロントゲルプレートの上端付近になるまでは、カセットの側を下にして実行することができ、カセット溶液を注ぐ。
- 、ゲルカセットの上部にきれいなゲルコームを挿入します。所定の位置に保持するために櫛を介してカセットにバインダークリップを配置します。スタッキングゲルは一晩に1時間重合してみましょう。
4。ゲルを保存する
- ゲルが完全に重合した場合には、バインダークリップを削除して、ヒートシール可能なプラスチック製の袋の中にカセット、または再シール可能なプラスチック袋を置きます。
- ポーチに0.1％アジ化ナトリウムが含まれている1Xスタッキングゲルバッファー20mlを注ぐ。
- 熱が5秒のために袋を密封して袋に入れて漏れがないことを確認してください。
- 4℃でゲルを保存する
5。サンプルの準備
- 薄肉のマイクロ遠心チューブ、タンパク質試料の6.5μlにまで追加して、2倍のNOVEXトリス-グリシンSDSサンプルバッファー7.5μL、100 mMジチオスレイトール（DTT）およびIRG-H 2 O（必要に応じて）を1μlで15μlの合計体積。
- ボルテックスによりサンプルを混合し、簡単にチューブの底に内容を持って来るためにサンプルを遠心します。
- 変性70℃サンプル℃で10分間。
6。ゲルを実行する
- NOVEXゲル装置を設定します。
- 内室へNupage酸化防止剤を500μl、及びトリス - グリシンが外側室にバッファを実行している300mlのが含まれているトリス - グリシン泳動緩衝液200 mlを追加します。
- ゲルローディングピペットチップを使用してウェルに変性したタンパク質サンプル（15μl）をロードします。
- 60から70分間、200Vでゲルを実行します。
7。ゲルを染色
- ゲル装置からカセットを取り出して、離れてゲルナイフや硬いパテナイフを使用して、2つのプラスチック製のゲルプレートを詮索好きで、エポキシシールを破る。ゲルを破れないように注意しながら、プレートからゲルを慎重に分離します。
- 穏やかに撹拌しながらIRG-H 2 Oで三回ゲルを洗浄します。
- 穏やかに攪拌しながら1時間インビトロジェンSimplyBlue SafeStainでゲルを染色する。
- 染色液を捨て、IRG-H 2 Oゲルを脱色
8。カセットのクリーニング
- 彼らは再び再利用できるようにカセットにすべてのエポキシこすり落とすか、皮に金属製のヘラを使用しています。
- 中性洗剤溶液をプラスチック製のゲルプレートのそれぞれを洗浄し、蒸留水、続いて水道水でよくすすいでください。
9。代表的な結果
エポキシ樹脂は、防水シール、（図1）を形成するので、カセットはアクリルアミド溶液は、それらに注がれたときにリークされません。さらに、ゲルカセットは簡単に染色ゲルを取得するために開くことができ、エポキシ樹脂は、その継続的な再利用を可能にするためにカセットから剥離することができます。図2に示すように、ゲルは、タンパク質マーカーとルーチンタンパク質の電気泳動に適したサンプルバンドの明確な分離を示しています。
図1。アプリミニゲルカセットを密封するためのエポキシ樹脂のカチオン。エポキシ樹脂の薄層は、従来のアセンブリへのカセットのいずれかのエッジに適用されます。エポキシ樹脂を強調するためには、このイメージの偽色の赤であった。
図2。 SDS-トリス-グリシンゲル上のタンパク質の分離は再使用ミニゲルカセットを使用して注いだ。上記のようにSDS-PAGEを行った。電気泳動後ゲルは、ミニゲルカセットから削除され、製造元の指示に従ってSimplyBlue SafeStainで染色し、送信された白色光を使用して撮影しました。レーンMはSeeBlue Plus2事前に染色された蛋白質の基準が含まれています。レーンM中のタンパク質の分子量はキロダルトン（kDa）のゲルの右側に示されています。他のレーンは、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）タグ付きタンパク質を発現する細菌からの清澄化ライセートからタンパク質を示しています。に示すタンパク質は、それらのgから洗浄されるGST-タグタンパク質の溶出の前にlutathioneビーズ。
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ディスカッション
タンパク質のゲル電気泳動は、ほとんどの分子生物学研究所のために不可欠な方法です。市販のミニゲルでは、利便性の高いレベルを提供していますが、コストがかかる場合があります。ここでは、市販のミニゲルの人気ブランドからミニゲルカセットを再利用する方法を示しています。このメソッドは、ゲルの既製のソースを持つことの利便性を保持しますが、市販のミニゲルの数分の一のコストで。この手順の重要なステップは、完全に漏れを防ぐために、未重合のアクリルアミドを追加する前にカセットを密封するためのエポキシ樹脂の正しい量を適用している。プラスチック製の定格されている場合にのみエポキシを使用し、製造元の指示に従って、エポキシの重合のための十分な時間を許可します。追加された利便性のために、複数のカセットは、前のゲルを注入して密封して保存することができます。分離ゲルを注ぐとき、tの高さよりも典型的には約0.5センチメートルより、スタッキングゲル用に十分な余地を残すようにしてください井戸を形成するために使用される彼は櫛。分離ゲルの重合時に、バッファ飽和1 - ブタノールは、分離ゲルの上に形成するために、まっすぐ、平らな表面を形成することをゲルが直立のように保つ。ゲルは30...
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
著者らは、AHに生命賞のUF科学ハワードヒューズ医学研究所に感謝
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| インビトロジェンNupage NOVEXミニゲルカセット（1.0ミリメートル） | インビトロジェン | NC2010 | 2、5、10、12、15、2次元の井戸で利用可能 |
| プラスチックエポキシ | ロックタイト | 108771 | |
| 電気テープ | スコットランドの | ||
| 125mlのサイドアームフラスコ | パイレックス | 5360 | |
| 4Xトリス·ベース分離ゲルバッファー | 1.5 M Tris塩基のpH 8.7 | ||
| アクリルアミド | フィッシャー·サイエンティフィック | 01065-500 | |
| ビスアクリルアミド | MPバイオメディカル株式会社 | 800173 | |
| 30.8％アクリルアミド溶液 | 30:0.8アクリルアミド：ビスアクリルアミドIRG-H 2 Oで | ||
| 10％のAPS | フィッシャー·サイエンティフィック | BP179-25 | 使用直前に調製した1ミリリットルIRG-H 2 O、0.1 gの過硫酸アンモニウム |
| TEMED | アルコスオーガニック | 138450500 | |
| 1X分離ゲル用緩衝液で飽和1 - ブタノール | 午前5時02分1X分離ゲルバッファーに1 - ブタノール | ||
| 4X Tris塩基スタッキングゲルバッファー | 1.5 M Tris塩基のpH 6.8 | ||
| ゲルの櫛 | インビトロジェン | NC3015 | 15よく、1.0 mm厚 |
| インパルスシーラー | TEW電気暖房機器 | ||
| ヒートシール可能なポーチ | Kapak / Scotchpak | 1パイントサイズ（6.5 "×8"） | |
| ゲル格納バッファ | 0.1％アジ化ナトリウムを含む1Xスタッキングゲルバッファー | ||
| NOVEX SDSトリス - グリシンサンプルバッファー（2X） | インビトロジェン | LC2676 | |
| DTT | FisherBiotech | BP172-5 | |
| 10XトリスGylcineランニングバッファー | インビトロジェン | LC2675 | 10X株式の1L：29.0グラムのトリスベース、144.0グラムグリシン、10.0グラムSDS |
| X細胞SureLockミニ細胞 | インビトロジェン | EI0001 | |
| ゲルナイフ | インビトロジェン | EI9010 | |
| ステインSimplyBlue安全 | インビトロジェン | LC6065 |
参考文献
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
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