末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。
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この記事について
サマリー
要約
末梢感覚神経線維によって検出し、物理的、化学的および熱的感覚刺激の主な処理は、動物とヒトの知覚に重要です。これらの末梢感覚神経線維は、特定の感覚刺激を検出し、開始する受容体やイオンチャネルタンパク質の茄多を表現する。方法はまた、これらの繊維の特定のイオンチャネルタンパク質の機能発現を同定するために利用することができる、皮膚を支配する末梢感覚神経線維の電気的特性を、特徴付けるために使用可能です。しかしながら、類似の電気生理学的手法は、骨などの最も挑戦的な組織を含む他の内臓器官を、支配する末梢感覚神経線維の受容体とイオンチャネルタンパク質の機能発現の検出のために（そしてまた、開発するのが難しい）は使用できません。さらに、そのような電気生理学的手法は、非興奮性タンパク質の発現を決定するために利用することはできない末梢感覚神経線維内のS。したがって、感覚神経のfivers用周辺/内臓の組織サンプルの免疫染色では、これらの神経線維に関心のある特定のタンパク質の発現を決定する最良の方法を提供します。これまでのところ、感覚ニューロンにおける蛋白質発現の研究のほとんどは、情報が特定のタイプまたは感覚ニューロンのサブセットの細胞体における特定のタンパク質の発現に限定されている知覚神経節、の手順を免疫染色に利用している。ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色のための周辺機器/内臓の組織サンプルの調製のための詳細な方法/プロトコルを報告する。我々は末梢感覚神経線維の免疫染色のためのマウスからの皮膚や足底のパンチ生検と骨（大腿骨）のセクションの準備のための具体的詳細の方法。これらのメソッドは、唯一の末梢感覚神経細胞におけるタンパク質発現の定性測定に重要なものではありませんが、またのための定量的なアッセイ方法を提供する感覚線維の特定のタイプまたはサブセットのタンパク質発現レベルの変化を決定するだけでなく、様々な病態時の感覚線維の数と密度の形態学的および/または解剖学的変化を決定するための。さらに、これらのメソッドは、感覚神経線維の染色に限定されないが、皮膚、骨や他の内臓組織における神経線維のいずれかのタイプの染色にも使用できます。
プロトコル
1。動物の灌流
本研究で実行されるすべての動物の手順は、アイオワ大学の動物実験使用委員会によって承認、および研究における動物の使用のためにNIHのガイドラインに従ってくださいされています。
- 灌流の前日に、4℃で1リン酸緩衝液のL（蒸留H 2 O、pH7.4の0.2 M PB）、および店舗を準備これは、血流やポスト固定のプロセスに使用されます。
- 30秒のためのガラスビーカー中でマイクロ波のddH 2 200mlのO：血の日に、0.1M PBで4.0％のパラホルムアルデヒド（PFA、pH7.4）で固定溶液、2タイプのマウスの灌流のための十分な量の500mlを準備するまたはそれは沸騰に近づくまで。ヒュームフードの下に絶えず撹拌しながらビーカーに粒状パラホルムアルデヒド20gの（PFA）を追加します。滴下し、溶液が透明になるまでかき混ぜる5 NのNaOH 5 mlを追加します。 PFAが完全に溶解したら、室温（RT）への解決策を冷却する。 SLO連続的に撹拌しながらwly 0.2 M PB 250 mlを加える。次第に弱い塩酸溶液（0.1 N〜1 N〜6 N）を使用して、7.4にpHを調整する。 500mlと氷の上で寒さに最終的な音量を調整します。また、氷の上のddH 2 Oとチルで1:1に希釈して0.2 Mのストックから0.1 M PB 400mlのを準備。
- ....
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ディスカッション
ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色と検出のためのマウスの皮膚と骨の組織切片の調製のための方法を紹介しています。足底パンチ生検から生成セクションは、両方の無毛と有毛皮膚を含む、これはプロトコルがどんな肌タイプに使用できることを意味します。これらの技術はまた、これらの組織内の他の細胞型（例えば、白血球、血管内皮、特に平滑筋）を染色するために用いることができる。これらのメソッドは、優れた最適な微細構造の保全との間の妥協（グルタルアルデヒド固定することによって達成されていますが、頻繁にエピトープと減少免疫染色の染色質の混乱の結果）と免疫細胞化学的検出能、厳密な方法で、手順に従っていれば、このステップバイステップを提供しています。
これらの組織における知覚神経線維の検出は、末梢神経突起伸長の調節の我々の理解を助けると4を発芽することができますよく別の病理学的条件下での末梢感覚求心性神経の解剖学的変化としての。さらに、正常な発達や病理学的状態における神経伝達物質、受容体、イオンチャネルや他の表現型マーカーの発現の変化はまた3,5-10を研究すること.......
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開示事項
利害の競合が宣言されない。
謝辞
彼女の継続的なヘルプと、この作業で建設的な批判のために博士とドナL.ハモンド、我々は、マウス足底パンチ生検の免疫染色の共焦点顕微鏡/イメージングの初期の標準化で彼の助けのための博士ユーリーM. Usachevに感謝。この作品は、NINDS / NIH（NS069898）からの補助金、およびDPMへの防衛前立腺がんの研究プログラムの国防総省（DoD - PCRP - 101096）からのアイデアの開発グラント賞によって資金を供給された
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| 材料名 | タイプ | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 3ミリメートルハリスマイクロパンチ | 材 | テッドペラ | 15094 | |
| 注入ポンプ | 材 | VWRインターナショナル | 23609-170 | |
| パラホルムアルデヒド | 試薬 | フィッシャーサイエンティフィック | T353 | |
| ピクリン酸 | 試薬 | シグマアルドリッチ | 239801 | |
| OCTの埋め込み化合物 | 試薬 | 組織- Tek社 | 4583 | |
| CYTO凍結低温エアゾールスプレー | 材 | 制御カンパニー | 3118 | |
| ヤギ血清 | 試薬 | シグマアルドリッチ | G9023 | |
| 免疫染色のためのインキュベーショントレイと蓋（大） | 材 | RPI社 | 248270（トレイ） 248270 -（蓋） | |
| ImmEdge疎水性障壁のペン | 材 | ベクターラボラトリーズ | H - 4000 | |
| ラクダの毛のブラシ（＃1厚さ） | 材 | テッドペラ | 11859 | |
| メディアをマウントするプロロングゴールド | 試薬 | インビトロジェン | P36930 |
参考文献
- Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).
- Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes....
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再版と許可
