我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
心筋細胞は、機能の1,2を最適化するために協働する期間の異なる複数のCa 2 +フラックスを持っている。のCa 2の変化は、細胞外の物質への応答で+活動は主にアセチルコリン3,4のような薬剤によって刺激され、原形質膜に局在化ホスホリパーゼCβ-Gαqの経路によって調節されている。我々は最近、カベオラ5,6と呼ばれる細胞膜蛋白質のドメインが活性化Gαqは 7を捕捉できることを見出した。この巻き込みは、Gαqの活性化状態を安定させ、心筋細胞や他の細胞型8の長期のCa 2 +シグナルの結果の効果があります。我々は生きている心筋細胞内の高速規模で動的なカルシウム応答を測定することにより、この驚くべき結果が明らかに。簡単に言えば、細胞は蛍光灯のCa 2 +インジケーターがロードされます。我々の研究では、我々は、Ca 2 +グリーン（Invitrogen社、で用いカルシウムイオンの結合により蛍光発光強度の増加を示すC.）。蛍光強度は、共焦点顕微鏡を走査型レーザーのラインスキャンモードを使用するために記録されます。このメソッドは、マイクロ秒の時間スケールでの時間トレースの数百を生成する、選択されたラインに沿ってピクセルの蛍光強度の経時変化を迅速に取得することができます。これらの非常に高速のトレースは分析のためにExcelにしてから、SigmaPlotのに転送され、電子ノイズ、フリー染料、および他のコントロールのために取得したトレースと比較されます。 Ca 2 +は別のフラックス速度の応答を分析するために、我々は時間とのピクセルの輝度をビンというのヒストグラム解析を行った。ビニングは、スキャンの500トレース以上のグループに私たちを可能にし、一つのプロット上に空間的かつ時間的にコンパイルされた結果を可視化する。従って、スキャンは、別のピーク位置やノイズによるオーバーレイされるときに識別が困難な、低速のCa 2 +波は容易に見ることができます。ビニングヒストグラム。測定の時間スケールで非常に高速なフラックスが長いのに対し、非常に短い時間ビンの強度の狭い分布を示すのCa 2 +波はより長い時間ビン以上の広い分布を持つビンのデータを示しています。これらの異なる時間の分布は、私達は、Ca 2のタイミング+細胞のフラックスを分析する、そして様々な細胞現象に与える影響を判断することができます。
プロトコル
1。カルシウムインジケータ付きのロードセル
- 35ミリメートルのガラスボトムマテック皿のプレートの細胞（またはチャンバーを表示し、他のガラスの底）。
- 10μg/mlラミニンと前室1泊目の主要な心筋細胞のコートを使用している場合。 KBのバッファ内のプレート心筋細胞（成犬、新生児ラット、または他の生物から単離された）（K -逆転のタイロード緩衝液HEPESの35ミリモル/ L、KClの140ミリモル/ L、KHCO 3の8ミリモル/ L、2ミリモル/ MgCl 2のL、および0.4 KH 2 PO 4、pH7.5のミリモル/ L）、37、15％ウシ胎児血清および1％streptamycinおよび0.5％ゲンタマイシンとインキュベートを添加したM199培地に徐々にそれを変える℃、5％のC CO 2。
- または室温で30-45分のための任意のカルシウム指示薬、カルシウム緑AM（Molecular Probes社1から5μM）で細胞をインキュベートします。色素の退色を避けるためにアルミ箔で皿に蓋をする。
- 14mmのEGTAとLeibovitz15培地で細胞を3回洗浄する（低カルシウムで実験を行う場合）または任意の適切な表示媒体。
- Leibovitz15培地containing14mM EGTAで別の30〜45分インキュベートする。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々は生きている心筋細胞の急激なカルシウムシグナルを表示して分離する手法を開発した。これらの測定の実験条件は、以前に他のセルのシステム10と同様に心筋細胞11に印加されているが、ヒストグラムとビンの分析の使用は、多くのCa 2 +のイベントが取得されるデータを可能にします。より高速なイベントは、容易にそれらの根拠となるメカニズムを理解するために適応遅いものとモデルから分離することができます。培養心筋細胞は、多くの主要な細胞株として、困難になる可能性があります。それは一般的に細胞が取得された後の測定がすぐに取られるべきであると考えられている一方で、我々は本研究で使用した大人の犬の心筋細胞はわずか3日後に彼らの固有の性質を失い始めることを発見した。この長い時間枠では細胞がしっかりと細胞はそのようなマイクロインジェクションのような潜在的に致命的な治療法を存続することを保証基板上に添付することができます。会社の添付ファイルは非常に重要ですマイクロインジェクションの成功のために。
我々は彼らの相互作用を妨害するペプチドをマイク.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、健康補助2R01 GM53132とP50 GM071558の国立研究所によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| DMEM | インビトロジェン | ABCD1234 |
参考文献
- Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).
- Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
