方法論記事

磁気ピンセットを用いた多重化単分子フォースタンパク質分解測定

DOI：

10.3791/3520

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2012年7月25日

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1Department of Chemical Engineering, Stanford University

この記事について

サマリー

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この記事では、高度に並列化可能な方法で単一分子レベルでのタンパク質分解酵素に作用する力の影響を研究するために磁気ピンセットの使用方法について説明します。

要約

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機械的な力の生成と検出は、癌転移1、アテローム2、治癒3を巻きに直接関連して、細胞生理学のユビキタスな側面です。これらの各例では、細胞はその周囲に力を発揮すると同時に、酵素的に細胞外マトリックス（ECM）を改造両方。 ECMでの力の影響は、このように4月7日 、その可能性が高い生物学的および医学的重要性のためにかなりの関心のある分野となっています。

このような光トラッピング8、原子間力顕微鏡9、磁気ピンセット10,11として単一分子技術は、研究者が個々のタンパク質に力を発揮することによって分子レベルでの酵素の機能を調べることができます。これらの技術のうち、磁気ピンセット（MT）は、低コスト、高スループットが特徴です。 MTは、1から100〜PNの範囲内で力を発揮し、ミリ秒の時間分解能を提供することができますよく単一分子レベル12で酵素機構の研究に一致している資質。ここでは、単一のタンパク質分子のタンパク質分解に力の影響を検討するための、高度な並列化MTアッセイを報告します。我々は、マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）による三量体のコラーゲンペプチドのタンパク質分解の具体例を提示しますが、このアッセイは、簡単に他の基質とプロテアーゼを研究するために適応させることができます。

プロトコル

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1。フローセルの準備

  1. カバーガラス（＃1.5、22x22 mmと22x40ミリメートル、VWR）は超音波を使用して掃除されています。
    1. カバースリップを保持する（ステップ2を参照）超音波に嵌合可能な小さなガラスの容器にカバースリップを追加します。
    2. イソプロパノールで容器を満たし、20分間超音波浴で超音波洗浄します。
    3. イソプロパノールを破棄してBarnstedミリQ装置または類似のデバイスによって生成された脱イオン水のおびただしい量でカバースリップをすすいでください。水で容器を満たし、20分間超音波洗浄します。
    4. 超音波処理した後、濾過し、埃のない空気の流れにカバースリップを乾燥させます。 （すなわち、汚れ）きれいに見える唯一のカバースリップを使用しています。
    5. 静かに炎が数秒間カバースリップは、残っているほこりや湿気からそれらをきれいにする：過剰な熱のためにカバースリップをワープしないように注意しながら、ブンゼンバーナーで生成ガスの炎を介してカバースリップを渡します。このステップでは、残留表面を削除します汚染物質。
  2. 両面スコッチテープを使用して、2つのカバースリップを添付してください。テープカット〜長さ3センチ、幅0.3センチメートル。真ん中の1.6 cmのチャネルを残して22x40 mmのカバースリップ上のテープを取り付けます。穏やかにテープが正しく付いていることを確認するためにカバースリッ....

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ディスカッション

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このプロトコルは、古典的な単一分子技術の新しい使用方法を説明します。磁気ピンセットは、コスト効率の高い方法で高スループットの単一分子アッセイの培地ができます。ただし、すべての実験手法と同様の課題や潜在的な落とし穴があります。

磁気ピンセットの制限事項

光学トラップに比べてMT装置の空間分解能と時間分解能が低い。また、ここで説明したシンプルなMTによって生成された力は、日常的にAFM実験でアクセスの力を大幅に下回る30 PNまたは以下である。この制限は、美徳であることができます：MTはよく、サブpNの力を適用するために適しています。

そのようなここ装置などの光学トラップやAFM、従来のMTとは異なり、個々の粒子の操作を許可されていません。光トラップは通常、MTは垂直引っ張り実験のために最高に適している一方で、カバースリップに平行に力を適用するために使用されています。 ElectromagneチックMTが増加し複雑さのコストであるが、これらの制限に対処します。

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開示事項

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利害の衝突が宣言されません。

謝辞

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この作品は、科学的インタフェース（ARD）、NIHのディレクターの新イノベーター賞プログラムを通じて国立衛生研究所（NIH）1-DP2-OD007078（ARD）、ウィリアム·ボウズ·ジュニアスタンフォード大学フェローシップ（ASAでバローズウェルカムキャリア賞によってサポートされていました）と、スタンフォード大学心臓血管研究所ヤンガー博士号を取得する前のフェローシップ（JC）。著者らは、顕微鏡検査機器を貸し出し用にジェームズSpudichに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号
マイクロカバーガラス＃1.5（22x22） VWR 48366-067
マイクロカバーガラス＃1.5（22x40） VWR 48393-048
ラムダDNA インビトロジェン 25250-010
T4 DNAリガーゼインビトロジェン 15224-041
マイクロコンウルトラYM-100 ミリポア 42413
抗ジゴキシゲニンロシュ·ダイアグノスティックス 11-333-089-001
Tween 20をシグマ P9416-100ML
抗 Myc抗体インビトロジェン 46から0603
ウシ血清アルブミンシグマ B4287-5G
ダイナビーズM-280ストレプトアビジンインビトロジェン 658.01D
ダイナMyOne T1ストレプトアビジンインビトロジェン 658.01D
P-Aminophenylmercuric酢酸カルビオケム 164610
ビオチン - マレイミドシグマアルドリッチ B1267
ビオチンは、オリゴを標識した IDT DNA カスタム合成
オリゴ標識したジゴキシゲニン IDT DNA カスタム合成
コラーゲンペプチド遺伝子 DNA 2.0 カスタム合成
MMP-1のcDNA ハーバードプラスミドデータベース
Z-変換 Thorlabs MTS50
翻訳者のためのサーボコントローラ Thorlabs TDC001

参考文献

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  1. Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
  2. Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (....

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