タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

サマリー

このメソッドは、実時間、速度、変位、速度など、さまざまな細胞への移行パラメータの定量的測定の細胞のモニタリングが可能になります。従来の方法とは異なり、このリアルタイムのアプローチは、エンドポイントの定量的な移行の測定値に基づいてされていません。代わりに監視し、継続的にさまざまなパラメータを計算することができます。

要約

細胞遊走は、胚発生、組織修復、免疫システムの機能、および腫瘍浸潤^1、2のために重要である動的なプロセスです。双方向の移行時に、細胞は細胞外の走化信号に応答して、基本的な運動機構が提供する本質的な手がかり³に対応して急速に移動します。細胞は、細胞が自分のローカル環境を探索することができ、低い固有の方向性を持っているときに、ランダムな移行が行われる。

細胞遊走は、初期応答セルに、複雑なプロセスである偏光を受けると移行²の方向に突起を拡張します。そのようなBoydenチャンバー遊走アッセイなどの移行を測定する従来の方法は、エンドポイントの結果としての移行を測定することができ体外で走化性を測定する簡単な方法です。しかし、このアプローチはどちらも個別の移行パラメータの測定を可能にしない。また、映像設備を許可しないセル移行時に受けることが形態学的変化のlization。

時間経過顕微鏡 - ここでは、私たちはビデオを使ってリアルタイムで移行する細胞を監視することができます方法を提示する。細胞の遊走および浸潤癌の特徴であるため、このメソッドは 、in vitro で癌細胞の遊走および浸潤を研究する上で適用されるものとします。血小板のランダムな移行は血小板機能⁴のパラメータの一つとして考えられてきた。したがって、このメソッドはまた、血小板の機能を勉強するのに役立つかもしれません。このアッセイは迅速で、信頼性、再現性という利点を有しており、細胞数の最適化を必要としません。セルのための生理学的に適切な条件を維持するために、顕微鏡はCO ₂の供給と温度サーモスタットが装備されています。細胞運動は、定期的に顕微鏡に取り付けたカメラを使用して写真を撮ることによって監視されています。細胞遊走は、平均速度と測定することによって計算することができます。Slidebookソフトウェアによって計算されますverage変位、。

プロトコル

1。コラーゲンをコートしたプレートの準備

1. のOpti-MEM培地で10μg/ mlの最終濃度コラーゲンを希釈する。
2. ステップ1からの各ウェルに1.5ミリリットルを追加することにより、コラーゲンコート6ウェルプレート、。一晩4℃でインキュベーションします。
3. 次の日に、1×リン酸でプレートを2回洗浄緩衝生理食塩水（PBS）とPBSに保存します。

2。 6ウェルプレート上の細胞の調製と種まき

注：細胞運動に最適な条件を確保するために暖かいメディアとPBSを使用します。

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でまばらにMDA-MB-231（浸潤性乳癌細胞株）に成長。この例では、MDA-MB-231を使用しますが、このメソッドは任意の接着性の癌と非癌性の細胞株に適用することができます。
2. 暖かい1X PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシン処理によって収集されます。 suコマンドを作るために顕微鏡下で細胞を確認する細胞は適切にトリプシン処理によって切り離されていることを再度。
3. 10％FBSを含むDMEM培地を添加することにより細胞を回収し、穏やかに5分間1000gで細胞をスピンダウンする。 10％FBSを含むDMEM培地で穏やかに細胞ペレットを再懸濁します。
4. 優しく上下にピペッティングにより、細胞ペレットを破る。可能な限り個々の細胞に細胞クラスターを打破することが重要です。
5. 細胞をカウントし、10％FBSを含むDMEM培地中の50,000細胞/ mlの最終濃度に希釈する。各ウェルに2 mlを分注します。
6. タイムラプス顕微鏡を開始するまで、一晩組織培養インキュベーター中で37℃でプレートをインキュベートします。
7. 移行のための十分なスペースを確保するために、ピペットチップを使用して傷を作成し、破片を（傷の結果として形成される）を削除し、10％FBSを含むDMEMを追加するには、1X PBSでプレートを洗浄します。浮遊細胞を顕微鏡で確認してください。多数の細胞がフローティングである場合、洗浄操作を繰り返します。今、プレート上でセットアップの準備ができている。画像取得のための顕微鏡。

3。顕微鏡のセットアップおよび自動化された画像の取得

自動画像取得のための顕微鏡を制御するいくつかのイメージング·ソフトウェア·パッケージがあります。ここでは、Slidebook 5.0イメージングソフトウェアを使用して自動取得は、取得し、最小限の毒性の速度が最も重要である生細胞アプリケーション用に優れていますEM-浜松C9100カメラに結合されたオリンパス顕微鏡（オリンパスIX81）、上で実行されます。システムは、ステージ上の環境制御室（ノイエライブセル）、および自動XYステージコントローラ（以前はPROSCAN）が含まれています。イメージが定義された時間間隔を使用して、明るいフィールドモードでは、10X UPLANFL Ph1/0.30目的で取得されます。次のプロトコルは、画像取得について説明します。

1. 顕微鏡、カメラ、ライブセルイメージング装置の電源をオンにします。顕微鏡のステージ上にプレートを置きます。ノイエ·ライブセル環境によってカバープレートCO ₂の供給と温度センサーに接続されているronmental制御室。 37 5％℃、CO ₂でサーモスタットを設定します。
2. SlideBookソフトウェアは、完全に自動化された客観的な選択、波長選択、蛍光と明視野法の間で簡単に切り替えが可能になります。フォーカスコントロールのさまざまなパラメータを設定するために、オープンSlideBookソフトウェアは、>をクリックして、メニューバー>を選択してフォーカスをコントロールに移動> 以下のパラメータを選択します。
   1. の "目的ボックス"ウィンドウドロップダウンリストから選択することにより目的を定義します。我々は位相の目的を使用していて、手動でコンデンサーに適切な位相リングを選択していることに注意してください。自動化されたコンデンサーを使用してシステムを使用している場合、これは自動的にソフトウェア·プログラムを介して設定されます。客観的な砲塔もコンデンサーもが自動化されている場合あるいは、これらはそれぞれのマニュアルを選択する必要がありますLY。
   2. "フィルターセット"ボックスで、次の
      1. 使用可能なフィルタを（我々のシステムのカメラのための "広視野"、接眼レンズのために "ライブ"を参照してください）​​するには、ドロップダウンボックスから接眼レンズまたはカメラのいずれかに光路を指示する設定を選択します。
      2. 明視野照明のために適切なフィルタを選択します（私たちのセットの上、このオプションは、明視野光路のために開いた位置を表す "DIC"のラベルが付いています）。
      3. 明視野シャッターを開くには、 "オープンブライト"をクリックして、光源を選択します。
3. アイピースの下にサンプルを表示するには、砲塔上に明るいフィールドフィルタを（我々のシステムの位置 "6"）を選択します。最初に適切なフィールドを見つけて、フォーカス（ステップ3.2.1 3.2.2.3）にサンプルを持って来るために接眼レンズを介してサンプルを表示した後。画像キャプチャ（我々のシステムの位置 "1"）のためにカメラに光パスを変更するフィルタターレットを移動します。
4. 自動化されたステージでは、異なるXYコーディネーターの選択を可能にする画像取得中に興味のある複数のフィールドをキャプチャするtesの。 SlideBookソフトウェアでは、フォーカス制御に移動し、 "XY"を選択し、イメージのキャプチャ（ 図1）それぞれの場所の"セットポイント"ロック]をクリックし、アイピースかかわらず、異なる位置を選択します。
5. 微調整画面に表示されているカメラ画像の焦点。これは、どちらかの非常に細かい単位でフォーカスを調整することができます顕微鏡やコンピュータコントロールを手動でコントロールを使用して達成することができる。
6. "フォーカス·コントロール"ウィンドウ内のコントロールを使用して、ステージのZ位置を調整します。最良の結果を得るには、プレートとの接触に近い平らな細胞の突起に焦点を当てています。
7. 焦点のために適切な範囲内にある露光時間を調整するスライダを使用して焦点を当てて支援する。複数のXY位置が選択されている場合、個々の位置にフォーカスを調整し、フォーカス制御の下で> XY>ポイントを参照してください。注：これはTH、確認するために行われますフィールドで正しく最適化スナップショットに集中しています。
8. キャプチャウィンドウのパラメータを設定するためのソフトウェアを使用しています。 SlideBookでは、選択してキャプチャを開くメニューバーから。 図2を参照してください。その後、次のパラメータを確認してください。
   1. 時間の経過などのタイプ>をキャプチャを確認してください。
   2. ワイドフィールド：DIC（明視野像）のフィルタセットを確認します。
   3. "時間経過のキャプチャは、"（それは細胞の種類によって異なります）キャプチャされる時点の数です。期間は、実験のための時間の合計の長さです。時間の単位[ミリ秒（ms）、秒（s）、分（m）または時間（h）]をドロップダウンメニューから選択することができます。
   4. "間隔"は1タイムポイントの最初と次のタイムポイントの始まりとの間の遅延です。これらの値のうちの2つの入力すると、3番目のフィールドは自動的に計算されます。
   5. 複数XYキャプチャ：選択して "マルチ1以上のXY位置のポイントリスト "を参照してください。
   6. ファイルに名前を付けます。与えられた例では、我々はそれを'231 'に名前を付けた。
9. により、複数の画像にコンピュータのシャットダウン予期しないを避けるために、ファイルを保存する "スプールオプション"を使用します。それはオプションですが、しかし、それは強くお勧めします。この目的のために、キャプチャの下contro lは> を選択して[詳細]> [ スプール > メモリにキャプチャし、各時点の後にスプールファイルに保存します。スライドブックファイル（ 図3）保存する場所を参照します。生成されたムービーは後で指定した場所からインポートすることができます。顕微鏡のセットアップの手順は、に要約されたファイル3.1 。

4。移行の画像処理と解析：速度と変位の計算

この例では、イメージ処理はSlideBoによって行われます^5、6、5.0ソフトウェア[OK]をクリックします。画像処理と解析のためのそのようなImageJの⁷のような他の様々なプログラムがあります。

1. 様々な時点で様々な分野の画像から生成されたSlideBookファイルをインポートします。メニューバーに移動します>画像の下に>インポート> スライドブックスプール >目的のファイル（ 図4a）を選択します 。
2. ここで私たちの目標は、個々の細胞の動きを追跡することです。それは、自動トラッキングや個々の追跡を使用して行うことができます。これは簡単に成果物を除外容易以降の例では、自動追跡をより困難である、マニュアルトラッキングを使用しています。
3. 我々は追跡を実行する必要があります。ているSlideBookファイルを開きます。メニューの下に：選択マスク > 粒子追跡プロトコル > マニュアル粒子追跡プロトコル （ 図4b）。ウィンドウには、開始時間と終了時間のポイント（ 図4c）で表示されます。
4. Begi各セルの中心（核）をクリックして、個々の細胞の動きを追跡するために、nである。追跡する各映画の約10細胞と少なくとも三つの異なるムービーは約30のセルが1つの実験から解析されるように、別の場所から選択する必要があります。各実験を3回繰り返す必要があります。公平なアプローチを可能にするには、そのような正面からのいくつかの細胞など、さまざまな場所からのセルを選択し、中央の、コーナー等が "OK"をクリックして、一回の追跡が行われます。
5. ランダムな移行がメニューの下に、データを分析するには、速度、速度または変位の変化などを測定することによって分析することができます> SELECT マスク > 粒子追跡>粒子追跡プロトコルです 。 （ 図5a）：以下、説明するようにトラッキングパラメータを選択します。
   1. を追跡する - あなたがドロップダウンリストから追跡したいパラメータを選択します。この例では、 エリアの中心 （、OBの中心の座標を使用しているジェクト）。
   2. "追跡し続ける"をクリックしてください。トラッキングが完了すると、これは自動的に次のステップに進みます。
6. このような変位と平均速度（ 図5bを参照）などの各パスの目的の統計情報を選択します。
   1. 平均スピード -総距離は、その距離を移動するために必要な時間で割った旅。
   2. 総排気量 -オブジェクトが移動する総距離。
   3. "計算して続行"あなたは、次のステップに進みたい場合、または、単にあなたが次のステップに行くことなく、統計情報を表示したい場合は、 "計算"を選択する]をクリックします。ファイルはテキストフ​​ァイルとして保存することができ、後でExcelにエクスポートすることができる生成されます。
7. 自動追跡プロトコルを使用してオブジェクトを追跡するためには、最初のマスクを作成する必要があります。
   1. >セグメントイメージ>セグメントのウィンドウが表示されたいマスクを選択して>しきい値が達成されるまで、選択したように9月他の人から一つのオブジェクトをarating>（ 図5cを参照）> [OK]を適用する]をクリックします。ステップ4.5.1は同じです。
   2. より小さいオブジェクトを削除 - 選択して指定されたサイズより小さいオブジェクトを削除するには、このチェックボックスをオンにします。編集フィールドのサイズを入力し、単位としてミクロンまたはピクセルのいずれかを選択します。これは頻繁に破片によって引き起こされるアーチファクトを除去するために使用されます。
   3. 最小の動き - パスを決定するために追跡されなければならない時点の最小数を入力してください。
   4. 最大運動 - 1つの時点から任意のオブジェクトから次へと予想される最大の動きを入力します。
   5. データを分析するための手順は、手動でトラッキング（ステップ4.5.2に4.6.2を参照）と同じです。

5。代表的な結果

ランダム移行解析の例は、速度と変位（ 図6）の観点で定量化した。ファイルtをエクスポートした後にOエクセルは、データがボックスとウィスカープロットを使ってプロットされます。テストとコントロール間の総変位と平均速度を比較する統計解析はMann-Whitney検定を使用して行われます。テストサンプルは、コントロールと比較して平均速度の増加を示しています。テストサンプルは、コントロールと比較して、総排気量の増加を示しています。

制御とテストの映画：コントロールMDA-MB-231およびテストMDA-MB-231細胞は、一晩コラーゲンに播種した。タイムラプスビデオ顕微鏡は、オリンパスの顕微鏡によって実行されるEM-浜松カ​​メラに結合させた。画像はランダムに移行中に18時間の合計1時間の間隔で撮影されます。コントロールおよび試験サンプルのランダム移動のムービー1、ムービー2を参照してください。

顕微鏡のセットアップ：

図1：画像に複数のポイントを設定するキャプチャします。

図2：キャプチャー·コントロールを描いた手順。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。どのように複数の画像を保存します。

dflinebreak "> 移行の画像処理と解析。

図4a、データ分析のためにイメージをインポートする手順。

図4b。粒子追跡プロトコルを使用してデータを分析するための手順。

図4c。追跡粒子の窓描いたパスの長さ。

データ解析の手順を実行します。

図5a。粒子追跡プロトコルのパラメータを描いた手順。

図5b。分析するパスの統計情報の選択。

図5cは、。自動追跡プロトコルのためのマスクを作成するステップ。

図6平均速度（ 図6a）と変位（ 図6b）がウィスカープロットにプロットされます。制御するために比較するようにテストサンプルは、速度と変位の増加を示しています。

ムービー

ムービー1。コントロール細胞の遊走は 、ムービーを表示するには、ここをクリック 。

映画2。試験細胞の遊走は 、ムービーを表示するには、ここをクリック 。

コントロールMDA-MB-231およびテストMDA-MB-231細胞は、一晩のためにコラーゲンをまばらに播種した。タイムラプスビデオ顕微鏡は、オリンパスの顕微鏡によって実行されるEM-浜松カ​​メラに結合させた。画像はランダム移行時に18時間の1時間の間隔で撮影されます。制御とテストのためにランダム移動のムービーを参照してください。

ディスカッション

リアルタイムランダム遊走アッセイは、速度や変位などの細胞遊走パラメータを正確に、機密性の高い、分析を可能にします。このメソッドは、より定量的であるので、ポイントの測定値を終了するには、制限されていません。ので、細胞は血清を正常DMEM培地で監視され、それは無血清培地におけるより長いインキュベーションの悪影響を減らすことができます。それは細胞の遊走は、書式設定、したがって、このメソッドは、移行上の異なる基質の効果を検討するために使用することができる基層⁸でセルの連絡先を壊すに依存していることが示されている。

重要なステップの一つは、最適な移行を確保するため、37 5％℃、CO ₂の温度を適切にコントロールが含まれます。アッセイは、希望する時点で渡り鳥の応答を監視するための柔軟性を可能にしますが、それは時間点の数を最適化することが必要な場合があります。たとえば、低い移行率を有するいくつかの細胞は、LOのために監視する必要がある場合がありますnger時間は、より高い移動率を有する細胞と比較されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH30243.01
FBS	ジェミニバイオ製品	100から106
OPTI-MEM	インビトロジェン	31985-070
コラーゲン	BD	354231
ライブセル室＆自動XYステージコントローラを搭載した顕微鏡	オリンポス	オリンパス1X81
環境制御室	ノイエ	ノイエ·ライブセル室	我々は、チャンバの上部を介して、適切な光学系のカスタム構築された長方形のガラス板の上を持っています。長方形の形状は、私たちのexperimenの多くで使用されるマルチウェルプレートに対応TS。
自動XYステージ	前の	前のPROSCAN	これは、正確なリターンが時間経過顕微鏡時に選択したXY位置を乗算することができます。
カメラ		浜松EMカメラC9100
ソフトウェア	典型的には、このようなオリンパス顕微鏡などのベンダーから購入し	スライドブック5