タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Summary

このメソッドは、実時間、速度、変位、速度など、さまざまな細胞への移行パラメータの定量的測定の細胞のモニタリングが可能になります。従来の方法とは異なり、このリアルタイムのアプローチは、エンドポイントの定量的な移行の測定値に基づいてされていません。代わりに監視し、継続的にさまざまなパラメータを計算することができます。

Abstract

細胞遊走は、胚発生、組織修復、免疫システムの機能、および腫瘍浸潤^1、2のために重要である動的なプロセスです。双方向の移行時に、細胞は細胞外の走化信号に応答して、基本的な運動機構が提供する本質的な手がかり³に対応して急速に移動します。細胞は、細胞が自分のローカル環境を探索することができ、低い固有の方向性を持っているときに、ランダムな移行が行われる。

細胞遊走は、初期応答セルに、複雑なプロセスである偏光を受けると移行²の方向に突起を拡張します。そのようなBoydenチャンバー遊走アッセイなどの移行を測定する従来の方法は、エンドポイントの結果としての移行を測定することができ体外で走化性を測定する簡単な方法です。しかし、このアプローチはどちらも個別の移行パラメータの測定を可能にしない。また、映像設備を許可しないセル移行時に受けることが形態学的変化のlization。

時間経過顕微鏡 - ここでは、私たちはビデオを使ってリアルタイムで移行する細胞を監視することができます方法を提示する。細胞の遊走および浸潤癌の特徴であるため、このメソッドは 、in vitro で癌細胞の遊走および浸潤を研究する上で適用されるものとします。血小板のランダムな移行は血小板機能⁴のパラメータの一つとして考えられてきた。したがって、このメソッドはまた、血小板の機能を勉強するのに役立つかもしれません。このアッセイは迅速で、信頼性、再現性という利点を有しており、細胞数の最適化を必要としません。セルのための生理学的に適切な条件を維持するために、顕微鏡はCO ₂の供給と温度サーモスタットが装備されています。細胞運動は、定期的に顕微鏡に取り付けたカメラを使用して写真を撮ることによって監視されています。細胞遊走は、平均速度と測定することによって計算することができます。Slidebookソフトウェアによって計算されますverage変位、。

Protocol

1。コラーゲンをコートしたプレートの準備

1. のOpti-MEM培地で10μg/ mlの最終濃度コラーゲンを希釈する。
2. ステップ1からの各ウェルに1.5ミリリットルを追加することにより、コラーゲンコート6ウェルプレート、。一晩4℃でインキュベーションします。
3. 次の日に、1×リン酸でプレートを2回洗浄緩衝生理食塩水（PBS）とPBSに保存します。

2。 6ウェルプレート上の細胞の調製と種まき

注：細胞運動に最適な条件を確保するために暖かいメディアとPBSを使用します。

1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）でまばらにMDA-MB-231（浸潤性乳癌細胞株）に成長。この例では、MDA-MB-231を使用しますが、このメソッドは任意の接着性の癌と非癌性の細胞株に適用することができます。
2. 暖かい1X PBSで細胞を2回洗浄し、トリプシン処理によって収集されます。 suコマンドを作るために顕微鏡下で細胞を確認する細胞は適切にトリプシン処理によって切り離されていることを再度。
3. 10％FBSを含むDMEM培地を添加することにより細胞を回収し、穏やかに5分間1000gで細胞をスピンダウンする。 10％FBSを含むDMEM培地で穏やかに細胞ペレ....

Discussion

リアルタイムランダム遊走アッセイは、速度や変位などの細胞遊走パラメータを正確に、機密性の高い、分析を可能にします。このメソッドは、より定量的であるので、ポイントの測定値を終了するには、制限されていません。ので、細胞は血清を正常DMEM培地で監視され、それは無血清培地におけるより長いインキュベーションの悪影響を減らすことができます。それは細胞の遊走は、書式設定、したがって、このメソッドは、移行上の異なる基質の効果を検討するために使用することができる基層⁸でセルの連絡先を壊すに依存していることが示されている。

重要なステップの一つは、最適な移行を確保するため、37 5％℃、CO ₂の温度を適切にコントロールが含まれます。アッセイは、希望する時点で渡り鳥の応答を監視するための柔軟性を可能にしますが、それは時間点の数を最適化することが必要な場合があります。たとえば、低い移行率を有するいくつかの細胞は、LOのために監視する必要がある場合がありますnger時間は、より高い移動率を有する細胞と比較されます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH30243.01
FBS	ジェミニバイオ製品	100から106
OPTI-MEM	インビトロジェン	31985-070
コラーゲン	BD	354231
ライブセル室＆自動XYステージコントローラを搭載した顕微鏡	オリンポス	オリンパス1X81
環境制御室	ノイエ	ノイエ·ライブセル室	我々は、チャンバの上部を介して、適切な光学系のカスタム構築された長方形のガラス板の上を持っています。長方形の形状は、私たちのexperimenの多くで使用されるマルチウェルプレートに対応TS。
自動XYステージ	前の	前のPROSCAN	これは、正確なリターンが時間経過顕微鏡時に選択したXY位置を乗算することができます。
カメラ		浜松EMカメラC9100
ソフトウェア	典型的には、このようなオリンパス顕微鏡などのベンダーから購入し	スライドブック5