同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

サマリー

ミバエ、キイロショウジョウバエは、その口吻または足根から糖刺激に応答して供給するために、その長い鼻を拡張します。私は、私たちは行動観察と同時に、脳内のニューロンの活動を監視することができ、カルシウムイメージング法を用いた口先拡張応答（PER）の観測を組み合わせている。

要約

行動でその機能の面で神経回路網を研究するために、我々は、それぞれの行動パターンが生成されたときにニューロンがどのように動作するかを分析する必要があります。したがって、神経活動と行動の同時録音が動作に脳の活動を関連付けるために不可欠である。そのような行動の分析のために、ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、私たちは 、そのようなGCaMP ¹として遺伝的にエンコードされたカルシウムインディケーターを組み込むために神経活動を監視するために、具体的にはニューロン^2-5を識別有効にするoptogeneticまたは熱発生を起こす技術のための洗練された遺伝子操作を使用することができます。熱発生を起こす技術を使用するには、摂食行動に重要なニューロン（フラッドら 、改訂の下で）を見つけるために私たちをリードしてきました。その長い鼻や足根上の感覚細胞からの甘い刺激に応答して、、摂食行動の主要な一部として、 ショウジョウバエの成体は^6（PER口先拡張応答）を供給するため、その長い鼻を拡張します。共同行動観察と同時に、suboesophageal神経節（SOG） - GCaMP3.0 ^1を使用^して、カルシウムイメージング法^8、9と^7％のプロトコルをmbining、私たちは摂食中枢のニューロンの活動を監視することができ、実験システムを確立しています口先の。その脳は水浸レンズを介して⁺イメージングのCa ²お風呂にさらされながら、口先が自由に移動できるように、 ショウジョウバエの成体を収容するために：私は装置（ "蝿" "フライ脳ライブイメージングと電気生理学的ステージ"）設計した。ハエはまた、電気生理学的記録やシナプス形態のタイムラプスイメージングなどハエの脳のライブ実験の多くの種類に適しています。ライブイメージングからの結果を直接同時PER挙動と相関させることができるので、この方法論は、神経回路網の情報処理を研究するための優れた実験系を提供し、どのようにこのCすることができますellular活動は、プラスチックのプロセスおよびメモリに接続されている。

プロトコル

1。ハエを構築

1. 側壁を溶融し、適切な角度と厚さ（;図2図1a）を形成するために、それを削って35ミリメートルファルコン皿の蓋からプラットフォームを形成する。口器は自由にチャンバー（ 図1a）の外部に露出されるようなフライのヘッド（ 図1a、b）を 、受け入れるためのプラットフォームに穴を開けます。フライが観察されるようにマッチングサイズは、ピペットマンのチップの先端をカットします。プラットフォームへの接着剤の先端を飛ぶ（ 図2）を完了するには、 図1Aに示すように。

2。観測のためにフライを準備する

1. 25℃で24時間大人のフライを餓死°C飢餓が必要な場合のみ、濡れたペーパータオルでバイアルに配置することによって、実験の前に。
2. 氷の上に立っている15ミリリットルプラスチックチューブ内に配置することにより、ハエを麻酔。
3. 鉗子を用いて、のチャンバー内にハエを挿入飛び、それが移動することができなくなるまでそっとでフライを押してください。その後、フライを保持するためにプラグを挿入します。 （ 図1a、b）に。
4. 穴の内側の縁に近吻（くちばし）の周辺部をシールし、側面に光硬化接着剤（Tetric EvoFlow）の少量を適用してから演壇の上に外側（ 図3の矢印）。また、ハエの中から頭と穴の内側の縁（ 図1b）の背側部分の間の空間に接着剤を適用します。演壇が自由に移動できるようにするには、注意が接着剤を広げるためにまつげを（または同等のもの）を使用して演壇に触れてから任意の接着を防ぐために注意する必要があります。最後に、過度の熱からフライの損傷を防ぐために、硬化するのに十分な青い光の弱い照明と接着剤を硬化させます。プラグを取り外します。
5. 演壇の一部（ 図3の矢印）解除を保持するスレッドがフライを安定させるために用いることができる"SOGに咽頭部のバンプを回避し、特に口吻が完全に収納されて咽頭の一部で覆われているGr5aニューロン⁸のイメージングシナプス前終末では、SOGの腹の部分を露出させることによってのヘッド。
6. 7.1 ¹⁰のpHを有するとHEPES-水酸化ナトリウム、5;のKCl、2;のMgCl _2、4.5;のCaCl _2、1.5のNaCl、140：無糖の生理食塩水を含有する（mMで）とプラットフォームの表面を記入してください。このスクロースフリー生理食塩水は、一般的に使用されるスクロース含有などHL3.1 ¹¹としてSalinesのと同様の等張性を持っています。
7. カスタムメイドのデバイスであり、もともとはSOG（ 図4）を公開するキューティクルと気管をクリップする博士Kageyuki山岡、日本によって設計されたはさみのような尖った先端とタングステンブレードと鉗子を用いて頭部カプセルを開きます。背側のエッジカットなどの重要ではなかったのに対し、頭のキューティクルの腹縁はできるだけ腹に切断した。最初を通して切開を作る後端は、タングステンブレードを使用します。その後、サイドと尖ったピンセットを使用して前方の縁を切って。カットキューティクル片をピンセットで持ち上げて、削除する必要があります。触角と触角神経が尖ったピンセットで切り取る必要があります。
8. 録音中に動きのアーチファクトを避けるために、脳はハエの特定の部分の除去を介して安定化する必要があります。最初に、選択的にSOGとキューティクルの間に空気袋を削除します。咽頭に向かって最後と最後に食道は咽頭と脳の間の接続を削除するには、SOGに入るカット。その後マッスル16 ^12を引き出し、最後に、脳とキューティクルを接続する任意の気管を切り離します。
9. 私たちは、回転するディスク共焦点顕微鏡システム（パーキンエルマーでImprovision）（ 図5）に接続されているオリンパスBX51WI顕微鏡のステージ上で私たちのハエを設定します。水浸レンズ、例えば、40X/0.8 NAは、お風呂（ 図6に浸漬した）。

3。 Ca ^{2 +の}脳のイメージング

1. GCaMP3.0 ^1を使用^してのCa ^{2 +}イメージング^、9マレラらによって確立されたメソッドを介して行われた^。8（ 図6）。スピニングディスク共焦点顕微鏡（Improvision）を使用して、関心領域（運動ニューロンの細胞体、または介在ニューロン、またはシナプス前終末に焦点を当て、491nmの励起レーザーを使用して122msの露光時間と4Hzのに単一の光学部を取る味覚感覚ニューロンの）速度ソフトウェアバージョンである。 4.3（Improvision）。

4。テングザルを刺激する

1. 先端（ 図7）から突出する小さな芯（和紙から作られた、 特定の試薬 ​​の表を参照）で皮下注射針に100mMの水溶液のショ糖溶液を吸引除去する。
2. 直ちに血友病、それを吸引し、その後、芯の上にショ糖溶液の小滴を排出する口吻の先端に浸した和紙の芯を適用する電子。和紙の芯は、飽食（ 図8）を避けるために、瞬時に適用する必要があります。テングザル拡張応答（PER）のCa ^{2 +}イメージングと同時に（ 図5）解剖顕微鏡に取り付けられたCCDカメラを用いて動作を監視することができます。 PER応答が一時間以上を維持されていないため、データはこれらの条件の下で解剖を開始した後一時間以内に撮影しなければなりません。

5。代表的な結果

演壇の分度器、口先拡張のための演壇を持ち上げるの責任の主要な筋肉のペアの運動ニューロンは、甘い刺激^13〜堅牢な応答を示すことが報告されています。 図9のCa ^{2 +}シグナルGCaMP3.0 ^1〜9で表される運動ニューロンの細胞体からギャル4ドライバ、E49 ^13。ビデオ、robuに示すように、セントPERは、Ca ^{2 +}シグナルの増加と同期して観察された。

図1。フライ脳ライブイメージングと電気生理学ステージ（ハエ）の概略。 、ハエはハエの頭はまっすぐ出てくるため、壁の角が許可されているように構築されています。ハエの口吻の3つのセグメントは、色分けされたです。演壇はマゼンタです。フライは、鉗子でチャンバー内に挿入され、ピペットマンのチップの端からカット部分がエスケープからフライをブロックするようにチャンバーの背面に差し込まれている。bは 、穴はハエの頭部に適合するように退屈されています。漏れがないことを確認するために示されるように残りのギャップは、光硬化性接着剤で密封されています。接着剤が硬化した後、プラグインとしてピペットマンチップが削除されます。生理食塩水は、脳の表面が完全に覆われているようなハエに注入される。それはない生理食塩水漏れがないことを確保する必要がありますハエの頭の前端に出る。パネルBの破線で囲まれた斜線部分を摘出する部分を示しています。

図2。ハエの写真。接着剤の三日月形の壁が（接着剤銃から）血中の食塩水の流れを制御するために、使用食塩水の量を減らすために行われます。

図3。ハエの正面には、光硬化接着剤は、生理食塩水防シールを作成するには、フライ（矢印）の頭の周りをどのように適用されるかこの画像はハエがハエに設定されている方法を示しています。ハエにマウントします。ハエの口吻に至るまで、任意の生理食塩水が漏れた場合、その後の実験は失敗します。ステージにつながスレッド（矢頭）は、完全にretracではないので、位置に口吻を保持することです。テッド。それ以外の場合は、SOGのより多くの腹部分を妨げ、動きのアーチファクトの原因となります。

図4。解剖フライでハエのトップビュー。このイメージはキューティクル除去後にフライの露出したSOGを示しています。食道、筋肉16、気管、脳に接続されているだけでなく、選択された空気袋は、カルシウムシグナルのアーティファクトにつながる可能性が脳を乱すからそれらを防ぐために削除されました。

図5。監視装置は、この装置は、回転するディスク共焦点顕微鏡システム（Improvision）、サイドマウントニコンSMZ800顕微鏡に接続されているオリンパスBX51WI顕微鏡から組み立てられます。このセットアップでは、PER動作時の脳活動のライブイメージングを可能にします。

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図6。ハエのサイドビューを表示する。生理食塩水の薄い層が40X水浸レンズとフライの間に挟まれている写真である 。

図7。和紙の芯を作るための模式図。Gampi-和紙は非常に薄く、滑らかである（榛原、日本）日本の伝統的な羊皮紙です。それはまた非常に強力であり、液体を大量に保持することができます。和紙は非常に特定の寸 ​​法を台形にカットしなければなりません。0.3ミリメートルと0.7ミリメートル幅で、長さ4〜5 mmの（）。この台形は、その後23 Gの注射針の先端に0.7ミリメートル側から挿入され、また、V字型（b）に曲がっている虫ピンの挿入を介して安定化させることができる。C、和紙のようになります透明性の暴露液体に、この実験に最適です。

図8。皮下注射針の先端に和紙の芯を持つハエ口吻の刺激。和紙の芯は、片手でジョイスティックマニピュレータを使用してインスタントに適用される。針は、ショ糖溶液を吸引して排出するため、もう一方の手で操作するインジェクタにフレキシブルチューブを介して接続されている。

図9。代表的な結果。実体顕微鏡に取付けたCCDカメラによって記録され、PER動作。飢えた刺激では刺激前に拡張された口吻（矢印）とハエ、および100 mMスクロース水溶液（矢印）を含む芯で刺激した後の正面ビュー。照明を使用する491 nmのレーザーによって達成されGCaMP蛍光B、飢餓状態にある演壇の筋肉の分度器のための運動ニューロンにおける糖誘発性GCaMP 3.0応答。刺激前にトップパネル;下部パネルは、すぐに刺激した後。スケールバーは、10μmである。C、ショ糖誘発性GCaMP 3.0応答の定量化。運動ニューロンは、ベースラインに数秒の回復相に続いて蛍光の急激な増加によって、ショ糖刺激に応答します。

ディスカッション

ハエは、Ca ^{2 +}シグナルとPERの動作の同時録画が可能になります。でも、生理食塩水、通常のPER行動にさらされる脳が観察された。オリジナルのキャピ​​ラリーmethod7で使用されているキムワイプの芯の代わりにGampi-和紙の芯を使用して動作PER高い再現性と安定を促進し、優れたキムワイプ芯を作り、選択に熟練したようになる必要がなくなります。実験的なヒントは、私たちが成功したCa ^{2 +}の非常に安定した記録につながる、口吻の動きによって障害を回避するために^、+の信号を低ノイズで許可されて上記の。時折、組織の除去は悪い結果につながる、細胞を公開したり、十分に運動を抑制するために十分ではなかった。しかし、一度我々は熟練した、準備の80％以上が良い結果を生んだ。この方法は、Ca ^{2 +}イメージングのためであるだけでなく、行動のPER観察しながら、また、任意のライブイメージングに適応することができます。たとえば、我々は、を介して任意のセルにアクセスできます。直接活動を記録するために電極の​​使用しています。二光子励起顕微鏡と組み合わせることで、我々は行動の変化に関連することができシナプスの構造の時間経過のイメージングを実行することができます。したがって、行動観察と脳イメージングのこの方法は、神経回路網の機能解剖のために貴重であるだけでなく、メモリの背後にあるメカニズムにシナプス可塑性^14を相関させる強力なツールとして使用することができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
機器/試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Tetric EvoFlow	Ivoclar vivadent	M04115	光硬化性接着剤
BX51WI顕微鏡	オリンポス	BX51WI	40X（NA 0.8）水浸対物レンズと
ディスク共焦点顕微鏡システムを紡績	パーキンエルマーでImprovision		491 nmのレーザーを用いた
実体顕微鏡	ニコン	SMZ-800	スイングアームに接続されている。ステレオビューは、まだビデオ録画で使用可能です
Gampi·和紙	榛原、日本		伝統的な和紙の特別な種類の
CCDカメラ	イメージングソース	DFK41AU02	1月2日の "1080×960画素SONY CCD
ジョイスティックのマニピュレータ	ナリシゲ	MN-151
インジェクター	ナリシゲ	IM-5B