私たちは、器官小脳スライス培養で増殖させ、個々のプルキンエ細胞の樹状突起の形態を表示して、定量的にロバにすることを可能にするプロトコルを提示。このプロトコルは、プルキンエ細胞の樹状突起の発達のメカニズムに関する研究を推進することを意図している。
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この記事について
サマリー
要約
彼らは矢状面で厳密に指向していて、小型げっ歯類で生後3期間で主に開発して印象的な樹の木を持っているので、プルキンエ細胞は、樹状突起発達を研究するための魅力的なモデル系である。さらに、いくつかの抗体が選択的かつ集中的に抗カルビンジンD28Kは、最も広く使用されている状態で、すべてのプロセスを含むプルキンエ細胞を標識が利用可能である。生きた細胞内で樹状突起の閲覧については、プルキンエ細胞11に選択的にEGFPを発現するマウスはジャクソンラボを介して利用できます。プルキンエ細胞の樹状ツリーの樹拡大のほとんどが実際に培養期間4中に行われているため器官小脳スライス培養細胞はプルキンエ細胞の樹状突起の開発を容易に実験的な操作を可能にする。我々はここでorganotypiで栽培プルキンエ細胞の樹状形態を表示および分析するための短い、確実かつ簡便なプロトコルを提示C小脳スライス培養。多くの目的のために、プルキンエ細胞の樹状ツリーの定量的な評価が望ましい。私たちは迅速かつ容易に抗カルビンジンステンド小脳スライス培養から決定することができる2つのパラメータ、樹状突起の大きさと分岐点の番号、に焦点を絞ります。これらの2つのパラメータは、プルキンエ細胞の樹状ツリーの変化の信頼性と敏感な指標を得ることができます。プロテインキナーゼC（PKC）活性PMAおよび代謝型グルタミン酸受容体1（mGluR1）と治療法の例を用いて、我々は樹状突起発達の違いを可視化し、定量的に評価される方法を示しています。豊富な樹木の存在の組み合わせ、選択的かつ強烈な免疫染色法、樹枝状のメカニズムを明らかにするためのプルキンエ細胞を作る強力なモデルシステムプルキンエ細胞特異的にEGFP発現と樹枝状成長とマウスモデルの期間をカバーする器官切片培養発展。
プロトコル
1。器官小脳スライス培養をセットアップする
小脳スライス培養を静的インキュベーション法10を用いて、生後8日目P（8）仔マウスから調製される。私たちの研究室では、B6CF1マウスを使用しています。いくつかの実験では、トランスジェニックマウスは、プルキンエ細胞で選択的にEGFPを発現するために使用された。スライス培養物の調製は、6仔マウスのくずのためにマウス子犬、すなわち3時間ごとに約30分かかります。すべての手順は、滅菌手術器械を持つ層流ベンチで無菌条件下で行われる。
- P8の仔マウスの小脳は実体顕微鏡を用いて氷冷調製培地（グルタ1:100含むMEM（Gibco社製商品番号11012）は、pH 7.3）中に脳から解剖されています。
- 小脳はマッキルウェーン組織チョッパーを用いて矢状方向に350μmの厚さのスライスにカットされます。
- スライスは、ミリポア細胞培養インサート（approx.6スライスに配置されている挿入、ミリポアPICM03050当たりs）と0.75ミリリットルウェルあたりのインキュベーション培地（48.35ミリリットル、MEM、25ミリリットルイーグル培地、25ミリリットルウマ血清、1ミリリットルグルタ私、滅菌10％グルコース、0.65 mlで6ウェルプレート中でインキュベートされる37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下で溶液、pH 7.3）℃すべ....
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ディスカッション
方法は器官小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞樹状突起の発達を研究するためにかつ定量的に樹状突起の大きさや樹状分岐点の数を測定することにより、プルキンエ細胞の樹状突起の拡大を評価することを可能にするここで提示。もちろん、プルキンエ細胞の樹状突起のより広範かつ洗練された定量的な分析は、総樹枝の長さを決定するSholl分析を実行したり、樹状突起のフラクタル次元を決定することにより、例えば、可能性があります。このタイプの分析のためには、通常、手動での例ニューロ·ルシーダ用として解析プログラムに全体のプルキンエ細胞の樹状ツリーをトレースする必要があります。これらのより洗練された方法は、確かに分析の優れたレベル（例1を参照のこと、6）を得たが、彼 らはより多くの時間を消費している、ここに提示された方法に比べてより専門的な機器と解析ソフトウェアを必要とします。ほとんどのアプリケーションでは、特定の状況でどこに変化プルキンエ細胞の樹状突起に相当し、質的に表示され、提示されたシンプルな方法で十分でしょうしました。それをP8マウス由来の器官小脳スライス培養は急速な樹状膨張によって特徴付けプルキンエ細胞の樹.......
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開示事項
動物実験は、1986年11月24日の欧州共同体理事会指令（86/609/EEC）に準拠して実施された、スイス当局が検討し、許可された。著者らは、開示することは何もない。
謝辞
この作品は、バーゼル大学、生物医学科、スイス国立科学財団（31003A-116624）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| 組織培養インサート | ミリポア | PICM 03050 PICM ORG50 | PICMORG50インサートは低いリムを持ち、顕微鏡でライブ文化の閲覧を許可 |
| MEM | Gibco社、Invitrogen社 | 11012044 | |
| グルタマックス1 | Gibco社、Invitrogen社 | 35050038 | |
| 基底Medumイーグル | Gibco社、Invitrogen社 | 41010026 | |
| ウマ血清 | Gibco社、Invitrogen社 | 26050070 | |
| ホルボール12 - myristaTE 13 - アセテート（PMA） | Tocris | 1201 | |
| （RS）-3,5 - ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG） | Tocris | 0342 | |
| ウサギ抗カルビンジンD-28K | Swant | CB38 | |
| 抗NeuN、クローンA60 | ケミコン、ミリポア | MAB377 | |
| ウサギ抗GFP | アブカム | Ab290 |
参考文献
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J.
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再版と許可
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