ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。
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方法論記事
ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用
この記事について
サマリー
要約
ヒトパピローマウイルス（HPV）などの局所感染を引き起こす病原体に特異的な、希少なT細胞の単離および特性解析における困難を克服するためのプロトコルが開発されました。その手順は、被験者からのT細胞エピトープを含むHPVタンパク質の領域の特定、インターフェロン-γ（IFN-γ）分泌に基づくペプチド特異的T細胞の選別、そしてT細胞クローンの増殖および特性解析です（Fig. 1）。被験者1は、生検により高グレード扁平上皮内病変と診断され、T細胞を採取した当日に治療のためLEEP（ループ電気切除術）を受けた患者でした1。重複する合成ペプチドを用いて実施したIFN-γ酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイにより、ヒトパピローマウイルス16型（HPV 16）のE6およびE7タンパク質内でT細胞エピトープを含む領域を特定しました（Fig. 2）。このアッセイから得られたデータは、T細胞エピトープを含む領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の数の推定、および市販の磁気ビーズ（CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA）を用いたIFN-γ分泌に基づく単離に使用されました。選別されたIFN-γ分泌T細胞は、1ウェルあたり1つのT細胞の増殖をサポートするため、照射したフィーダー細胞混合物の存在下で希釈し、単独で培養しました。これらのT細胞クローンは、必要となるT細胞クローン細胞数を最小限に抑えるため、特定された領域をカバーするペプチドおよび自己由来のEpstein-Barrウイルス形質転換Bリンパ芽球様細胞（LCLs、WallsおよびCrawfordの記述に従い取得）2の存在下で、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いてスクリーニングされました。ELISPOTアッセイで通常用いられる1ウェルあたり1 x 105個の細胞1,3の代わりに、1 x 105個の自己LCLs存在下で1,000個のT細胞クローン細胞を使用し、これにより必要なT細胞クローン細胞数を劇的に減少させました。自己LCLsは、T細胞クローン細胞にペプチドアンテゲンを提示するだけでなく、ウェル内の高細胞密度を維持することで、エピトープ特異的T細胞クローン細胞によるIFN-γ分泌を可能にする役割を果たしました。これにより、IFN-γ ELISPOTアッセイの確実な遂行が保証されます。同様に、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いて、CD8 T細胞エピトープ（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）の最小および最適アミノ酸配列と、そのHLAクラスI制限要素（B58）を特性解析しました。また、HPV 16 E6またはE7タンパク質を発現するワクシニアウイルスに感染させた自己LCLsを用いてIFN-γ ELISPOTアッセイを実施しました。その結果、E6 T細胞エピトープが内因的に処理されることが示されました。さらに、他の高リスクHPV型の相同なT細胞エピトープに対する交差認識が示されました。この手法は、CD4 T細胞エピトープの記述にも利用可能です4。
プロトコル
被験者1から樹立したCD8 T細胞株を用いてIFN-γ ELISPOTアッセイを行った結果、HPV 16 E6の46-70領域にT細胞エピトープが含まれていることが判明し1 (図 2)、本プロトコルの開始前に、IFN-γの分泌に基づいてエピトープ特異的T細胞が選別された (図 1)。
1. エピトープ特異的T細胞の限界希釈
- 1%プールヒト血清を含む完全Yssel培地を用い、放射線照射（4,000 rad）した同種末梢血単核細胞（PBMCs）を5 x 105 cells/ml、放射線照射（5,000 rad）した同種LCLsを5 x 104 cells/ml、およびフィトヘマグルチニン（PHA）を0.1 μg/mlの濃度で混合し、フィーダー細胞混合液を調製する。なお、プロトコル全体を通して、細胞は無菌条件下で取り扱うこと。
- 分離したエピトープ特異的T細胞（図 3）を、濃度が0.5 cell/100 μlまたは5 cells/1 mlになるまで、フィーダー細胞混合液を用いて連続希釈する。エピトープ特異的T細胞は約3 x 103個を使用する。
- マルチチャンネルピペッターを用い、希釈したエピトープ特異的T細胞を、合計30〜60枚の96ウェル round bottomプレートに100 μl/wellずつ播種する。
- プレートを37 °C、5% CO2のインキュベーター内で培養する。
- 5日目に、20 u/mlのリコンビナントヒトインターロイキン-2（rhIL-2）を含む完全Yssel培地を100 μl添加する。
- 96ウェル round bottomプレートにおいて、底部のペレットサイズが大きいことから、増殖しているT細胞クローンを視覚的に特定する。
- 11〜14日目に、完全Yssel培地を用いて、放射線照射（4,000 rad）した同種PBMCsを1 x 106 cells/ml、放射線照射（5,000 rad）した同種LCLsを1 x 105 cells/ml、およびPHAを0.1 μg/mlの濃度で混合し、新しいフィーダー細胞混合液を調製する。この新しいフィーダー細胞混合液を、24ウェルプレートに1 ml/wellで播種する。
- 約200 μlの容量を保持できるマイクロピペッターを用い、各ウェルからT細胞クローンを個別に吸引する。
- T細胞クローンを、新しいフィーダー細胞混合液を含む24ウェルプレートに個別に分注する。すべてのT細胞クローンの移送が完了するまでこれを繰り返す。
2. 高スループットスクリーニングELISPOTアッセイを用いたエピトープ特異的T細胞クローンの同定（Larsson et al.5 による方法を改変）
- 2枚の滅菌済みELISPOTプレート（Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA）に、滅菌済み組織培養グレードのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で5 μg/mlに希釈した一次抗IFN-γモノクローナル抗体（clone D1K, Mabtech, Stockholm, Sweden）を50 μl/wellでコーティングし、4 °Cで最低1時間静置する。
- 150〜200 μl/wellのPBSをプレートに加えては捨てることで、ウェルを洗浄する。この操作をさらに3回繰り返す。
- RPMI 1640を用いて5%に希釈したプールヒト血清を50 μl/well加えて、37 °C、5% CO2で1時間以上静置し、非特異的結合をブロックする。大きな気泡がある場合は、滅菌済みニードルで潰して除去する。
- 1ウェルあたり50 μlの5%ヒト血清含有RPMI 1640に、1 x 105個の自家 LCLs2を分注する。
- T細胞クローンを含む24ウェルプレートの各ウェル内の細胞を、1 mlピペットを用いて混合する。各ウェルから100 μlを滅菌済みEppendorfチューブに移す。各Eppendorfチューブに500 μlの5%プールヒト血清含有RPMI 1640を加え、マイクロ遠心機で3,000 RPMで5分間遠心分離する。
- Eppendorfチューブの上澄みを捨て、1本あたり110 μlの5%ヒト血清含有RPMI 1640を加え、ボルテックスを用いて細胞を再懸濁する。
- 迅速スクリーニングのため、細胞数にかかわらず、特定のT細胞クローンを含む培地を50 μlずつ、2枚のプレートの同一位置にあるウェルに分注する。すべてのT細胞クローンについてこれを繰り返す。細胞計数ステップを省くことで、多数のT細胞クローンを一度にテストできる。
- 複数のEppendorfチューブから残りの培地をまとめ、PHAを添加する陽性コントロールウェルとして使用する次の同一位置のウェルに50 μlずつ分注する。
- T細胞クローンを含まず、陰性コントロールウェルとして使用する各ウェルに、5%プールヒト血清含有RPMI 1640を50 μlずつ加える。
- 陽性領域（Table 1）に含まれるペプチドを、最終濃度が10 μM/peptideとなるよう、50 μl/wellで加える。ペプチドストックは、ペプチドの溶解度に応じて、PBS中の5%〜15%ジメチルスルホキシドでそれぞれ5mMに溶解させておく。各ウェルの総量は200 μlとなる（ブロッキング液50 μl、LCLs 50μl、T細胞クローン 50μl、ペプチド 50μl）。
- 陽性コントロールウェルにPHA（最終濃度 10 μg/ml）を50 μl加える。
- 陰性コントロールウェルに5%プールヒト血清含有RPMI 1640を50 μl加える。
- 37 °C、5% CO2で一晩インキュベートする。
- 0.05% Tween-20含有PBSを150〜200 μl/well加えては捨てることで、ウェルを洗浄する。この操作をさらに3回繰り返す。
- 1 μg/mlのビオチン標識抗IFN-γモノクローナル抗体（clone 7B-6, Mabtech）を含むPBSを50 μl加え、37 °C、5% CO2で2時間インキュベートする。大きな気泡がある場合は、ニードルで潰して除去する。
- 2時間のインキュベーション終了20分前に、0.1% Tween-20含有PBS 5 mlに溶液Aおよび溶液Bを各2滴加えて、アビジン結合ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ H（Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）を調製する。
- 0.1% Tween-20含有PBSを150〜200 μl/well加えては捨てることで、ウェルを洗浄する。この操作をさらに3回繰り返す。
- ビオチン化ホースラディッシュペルオキシダーゼ Hを50 μl/well分注し、37 °C、5% CO2で1時間インキュベートする。大きな気泡がある場合は、ニードルで潰して除去する。
- 0.1% Tween-20含有PBSを150〜200 μl/well加えては捨てることで、ウェルを洗浄する。この操作をさらに3回繰り返す。
- stable diaminobenzidine（DAB）という発色試薬を室温で50 μl/well分注し、5分間静置する。大きな気泡がある場合は、ニードルで潰して除去する。
- 脱イオン水を150〜200 μl/well加えては捨てることで、ウェルを洗浄する。この操作をさらに2回繰り返す。
- プレートを完全に乾燥させる。
- 実体顕微鏡または自動ELISPOTリーダー（AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany）を用いてスポット数を計数する。
3. ELISPOTアッセイを用いたT細胞クローンのエピトープ特異性の確認（図4）
- 良好に増殖しているT細胞クローンを選択する。上述の手法に従いELISPOTアッセイを行うが、1ウェルあたり1 x 105個の自家LCLと1 x 103個のT細胞クローン細胞を、当該領域に含まれる3種類のペプチド（表1）をそれぞれ10 μMの濃度で添加して播種する。アッセイはn=2またはn=3で設定する。
4. エピトープが内因的に処理されるかの決定（図5）
- 良好に増殖しているT細胞クローンを選択します。上述の手順に従いELISPOTアッセイを実施しますが、1 x 105 HPV 16 E6およびE7を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させた自己LCL（リンパ芽球様細胞系） 6 （アッセイ前）またはなし（野生型、WR株）（1時間の感染多重度5）および1 x 103 1ウェルあたりに播種するT細胞クローンの細胞数を決定します。
5. T細胞エピトープの最小および最適配列の特性評価（図6a、6bおよび6c）
- 十分に増殖したT細胞クローンを選択する。上述の手法に従ってELISPOTアッセイを行う。ただし、1ウェルあたり1 x 105個の自己LCLと1 x 103個のT細胞クローン細胞を、当該領域をカバーする一連のオーバーラップ9-merペプチド（Table 1）のいずれかを10 μMの濃度で添加してプレートに播種する（Fig. 6a）。
- 上述の手法に従ってELISPOTアッセイを行う。ただし、1ウェルあたり1 x 105個の自己LCLと1 x 103個のT細胞クローン細胞を、長さの異なる一連のペプチド（Table 1）のいずれかを10 μMの濃度で添加してプレートに播種する（Fig. 6b）。
- 上述の手法に従ってELISPOTアッセイを行う。ただし、1ウェルあたり1 x 105個の自己LCLと1 x 103個のT細胞クローン細胞を、最小限かつ最適なアミノ酸配列を含む可能性が最も高い少数のペプチドと共にプレートに播種する。これらのペプチドを10-5 Mから10-10 Mの濃度範囲でテストする（Fig. 6c）。
6. ELISPOTアッセイを用いた制限エレメントの同定（図7）
- 良好に増殖しているT細胞クローンを選択します。上述の手順に従ってELISPOTアッセイを実施しますが、1ウェルあたり1 x 103個のT細胞クローン細胞を、10 μMの最小および最適ペプチドと共に播種します。また、研究対象者と1つまたは2つのHLAクラスI分子を共有する同種LCLを、1ウェルあたり10万個播種します。
7. 他の高リスクHPV型の相同アミノ酸配列に対するエピトープ特異的T細胞クローンの交差反応性の検討（図8）
- 良好に増殖しているT細胞クローンを選択する。上述の手法に従いELISPOTアッセイを行うが、1ウェルあたり1 x 103個のT細胞クローン細胞を、他の高リスク型HPV由来の相同アミノ酸配列を含むペプチド（10 μM）と共に播種する（表2）。また、1ウェルあたり10万個の自家LCL、および制限的HLAクラスI分子を発現する同種LCLを、それぞれのウェルに播種する。
8. 代表的な結果
本研究で提示する被験者1は、生検により高グレード扁平上皮内病変（HSIL）の診断を受けた22歳の非ヒスパニック系アフリカ系アメリカ人女性である。彼女はT細胞を採取した当日に、ループ電気切除術による治療を受けるために来院した1。彼女のCD8 T細胞ラインのELISPOTアッセイにより、HPV 16 E6 46-70領域（各領域は3つのオーバーラップする15-merペプチドでテストされる）にT細胞エピトープが含まれていることが示された（Fig. 2）。IFN-γ分泌に基づいて選別されたエピトープ特異的T細胞数は1.2 x 105であった。選別された細胞の5分の1に対して限界希釈法（Fig. 3）を行った後、262のT細胞クローンを回収した。T細胞クローニングの初回試行が成功したため、残りの選別細胞は使用しなかった。これらのクローンのうち94クローンに対して実施したハイスループットスクリーニングELISPOTアッセイにより、肉眼で容易に識別可能な62のスクリーン陽性クローンが特定された。最初のELISPOTアッセイでペプチド特異的T細胞クローンが特定されたため、残りのT細胞クローンはテストしなかった。増殖性の良好な8つのスクリーン陽性クローンについて、当該領域をカバーする3つの15-merペプチドを用いて個別に再テストした（Fig. 4）。すべてのT細胞クローンがHPV 16 E6 51-65ペプチドに対して陽性であり、8クローン中6クローンがE6 46-60ペプチドに対して陽性であり、E6 56-70ペプチドに対して陽性となったクローンはなかった。HPV 16 E6タンパク質またはE7タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスに感染させた自己LCLを用いたテストにより、T細胞クローンが内因性にプロセシングされたE6エピトープを認識することが実証された（Fig. 5）。HPV 16 46-65領域をカバーする一連のオーバーラップする9-merペプチドを用いたテスト（Table 1）では、E6 53-61ペプチドで最大の反応が示された（Fig. 6a）。E6 53-61ペプチドを含む2つの10-merペプチド、E6 53-61ペプチドに含まれる2つの8-merペプチド、および2つの10-merペプチドを含む1つの11-merペプチドをテストした結果、E6 52-61 (10-mer) ペプチドが最も一貫して最小かつ最適な配列であった（Fig. 6b）。しかし、T細胞クローン#79においては、E6 53-61 (9-mer) ペプチドも同等に強い反応を示した。このT細胞クローンを用いて、これら2つのペプチドをより広い濃度範囲でテストしたところ、低濃度のペプチドにおいてE6 52-61 (10-mer) ペプチドの方がE6 53-61 (9-mer) ペプチドよりもはるかに効果的に陽性を維持した（Fig. 6c）。目的は強固な反応を示す最短の配列を定義することであったため、より長いE6 52-62 (11-mer) ペプチドはテストしなかった。最終的に、E6 52-61 (10-mer) ペプチドが最小かつ最適な配列であると決定された。
CD8 T細胞エピトープの制限HLAクラスI分子は、被験者と共通の1つまたは2つのHLAクラスI分子を発現する同種LCLを用いたELISPOTアッセイにより検討することができます。しかし、被験者1については、ELISPOTアッセイで高いバックグラウンドが認められたため、結果は決定的なものではありませんでした。その後、クロム放出アッセイを用いて、被験者1のHLAクラスI制限分子がB58であることが特定されました（データは示さず）。図7は、別の被験者［Wang et al.7に記載されているE6 75-83 (KFYSKISEY) の最小および最適配列を検出することが判明した被験者A］の例を示しています。B62およびCw3分子を発現するLCLでは高い陽性反応が見られ、一方でCw3を発現するLCLではバックグラウンドの陽性反応が示されています。クロム放出アッセイにより、被験者Aの制限因子がB62分子であることが確認されました7。
HPVゲノムのいくつかの領域は高度に保存されており、HPV 16 E6 52-61領域への相同配列が他の13種類の高リスクHPV型に認められた（表2）。高リスクHPV 13型のうち8型において、強力な交差認識（HPV 16 E6 52-61ペプチドに対するスポット形成単位の>50%）が示された（図8）。
図1. 新規T細胞エピトープを特性評価するための一連の実験を示す概略図。本論文では、上から3番目のボックスから始まるプロトコルについて記述する。
図2 T細胞エピトープを含む領域を特定するために実施されたELISPOTアッセイ。刺激した10万個のCD8 T細胞 in vitro ウェルあたり、HPV 16 E6およびE7タンパク質内の各領域をカバーする3つの15量体オーバーラップペプチド（各10 μM）とともに播種した。被験者1のこの例では、E6の46-70領域にT細胞エピトープが存在することが示された。バーは平均値の標準誤差を表す。
図 3. フィーダー細胞混合物を用いて、エピトープ特異的T細胞を1ウェルあたり0.5細胞の濃度に希釈する方法を示すスキーム。
図 4. 3種類の15量体ペプチドを個別にテストし、T細胞エピトープを含むサブ領域を特定するために実施したELISPOTアッセイ。被験者1のこの例では、E6 46-60およびE6 51-65のサブ領域にエピトープが存在することが示された。バーは平均値の標準誤差を表す。
図5. T細胞エピトープが内因性に提示されるかを確認するために実施したELISPOTアッセイ。被験者1のこの例では、T細胞クローンが内因的に処理されたE6エピトープを認識していることが明らかになった。棒は平均値の標準誤差を示す。
図6. T細胞エピトープの最短かつ最適なペプチド配列を特性評価するために実施したELISPOTアッセイ。利用可能な場合は、全工程で同一のクローンを使用した。(a) オーバーラップさせた9量体ペプチドを用いて実施したELISPOTアッセイ。被験者1のこの例では、エピトープがE6 53-61サブ領域に存在することが明らかになった。(b) 様々な長さのペプチドを用いて、最小かつ最適なペプチド配列を特定するために実施したELISPOTアッセイ。この例では、最短かつ最適なペプチド配列が、最も一貫してE6 52-61ペプチドであり、次いでE6 53-61ペプチドであることが明らかになった。(c) どのペプチドに最小かつ最適な配列が含まれているかを確認するために実施したELISPOTアッセイ。E6 52-61ペプチドはより低い濃度でも陽性反応を維持したため、これが最短かつ最適な配列であると決定された。バーは平均値の標準誤差を示す。
図7. 制限的HLAクラスI分子を特定するために実施したELISPOTアッセイ。この例は、HPV 16 E6 75-83エピトープ7を認識する被験者AのCD8 T細胞クローンの制限因子がB62分子であるという考えを支持した。これはクロム放出試験によって確認された。バーは平均値の標準誤差を表す。
図8. HPV 16 52-61特異的T細胞クローンの、他の高リスクHPV型の類似配列に対する交差反応性を評価するために実施したELISPOTアッセイ（表2）。被験者1のこの例では、検討した他の13の高リスクHPV型のうち8つにおいて、有意な交差反応性（HPV 16 52-61と比較して>50%の陽性率）が認められた。棒グラフは平均値の標準誤差を示す。
| HPV型 | アミノ酸残基* | 配列^ |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | FRDLCIVY |
* アミノ酸数は括弧内に示されています。
表1. 最小および最適な抗原性ペプチド配列を定義するために使用したHPV 16 E6ペプチドのアミノ酸配列。
| HPV型 | A A 残基* | 配列^ |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFKDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | FAFTDLTIVY |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFADLTVVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | FACYDLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VAFTEIKIVY |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFTDLRIVY |
| 56 | E6 48-57 (10) | FACTELKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVFADLRIVY |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNDLFIVY |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFGDLNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* アミノ酸の数は括弧内に示されています。
^ HPV-16 E6 52-61エピトープとは異なるアミノ酸残基は太字で示されています。
表 2. 交差認識を評価するために試験した、HPV 16 E6 52-61 CD8 T細胞エピトープに相同な高リスクHPV型のペプチドアミノ酸配列。
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ディスカッション
従来、免疫学者は、目的のT細胞をin vitroで刺激し、限界希釈実験を行ってエピトープ特異的なT細胞クローンを単離させることで、新規T細胞エピトープの特性解析を試みてきました。その後、クロム放出アッセイを用いてT細胞クローンの特性を評価していました8,9。しかし、T細胞の頻度が低すぎて単離できなかったり、特性解析を完結させるのに十分な数のT細胞クローン細胞が得られなかったりしたため、多くの試みが不成功に終わりました。本手法では、(1) 目的のT細胞が十分な数存在するかを評価し、(2) IFN-γ分泌に基づいて選択することで目的のT細胞の頻度を高め、(3) 自家LCLをT細胞クローン細胞と共に播種するELISPOTアッセイを行うことで、少数のT細胞クローン細胞で解析を可能にし、これらの制限を克服しています。Fig. 2には、潜在的なT細胞エピトープが存在する領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の頻度を評価するために行われたELISPOTアッセイの例を示しています。エピトープ特異的T細胞の推定数は、目的領域のスポット形成ユニットから、ペプチドなしの陰性対照の...
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開示事項
著者は開示すべき事項がないことを表明します。
謝辞
本研究は、American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) および NIH 助成金 (R01 CA143130 および UL1RR029884) の支援を受けて行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CD8 T細胞分離キット | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| フィトヘマグルチニン | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/vial |
| Yssel’s medium | Gemini Bio Products | 400-102 | 1% プールヒト血清 |
| 96ウェル丸底プレート | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| リコンビナントヒトIL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| 24ウェルプレート | Corning | 07-200-84 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| 一次抗IFN-γモノクローナル抗体 (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| ビオチン標識抗IFN-γモノクローナル抗体 (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Multiscreen HA ELISPOTプレート | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| ジメチルスルホキシド | Sigma-Aldrich | D2650 | 100 ml ボトル |
| プールヒト血清 | Atlanta Biologicals | S40510H | 熱不活化 |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Vectastain Elite ABCキット | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| 安定化ジアミノベンジジン | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
参考文献
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- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
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