のメタボロームプロファイル結核菌ブロス培養で成長した後に決定されています。条件は、この微生物の代謝プロファイルに栄養補助剤、酸化剤、抗結核剤の効果をテストするために変化させることができる。抽出物調製のための手順は、1Dの両方に適用されます 1 Hと2D 1 H- 13 C NMR分析。
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この記事について
サマリー
要約
結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ（MDR）と広範囲に（XDR）の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴（NMR）は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元（1D）1 H NMRおよび2次元（2D）の1 H-13 C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。
プロトコル
1。プロトコルテキスト
このプロトコルは、MにNMRの方法論の適応を強調結核 （クラスIIIエージェント）。 M.を行う際にそのため、生物学的安全性レベル3（BSL3）プラクティスが従う必要があります毎年認定された研究室での結核研究。実験室で生成されたエアロゾルへの暴露では、これらの微生物を扱う担当者が直面する最も重要な危険である。以下の手順は、我々の施設で行われているとバリエーションがインスティテューバイオセーフティ委員会の勧告に基づいて存在するかもしれません。共通の人員保護具は、タイベック·スーツ、フワフワヘアキャップ、ブーツ、N95マスク、目の保護具、スリーブ、ニトリル手袋の二重ペアで構成されます。 M.伴う作業オープンMと結核培養および/ または操作結核容器はタイプA2またはB2生物学的安全キャビネットの中で行われる。プラスチックで覆われた吸収紙はw上に配置され表面をorking。配置された、または施設から削除するすべての材料/消耗品は2バイオハザードバッグに入れ、オートクレーブで除染しなければなりません。キャビネット（FastPrep-24溶解ホモジナイザー、分光光度計、氷と一緒にバケツなど）内で利用される作業面および機器は、1％Amphyl（結核菌殺菌、殺真菌、および殺ウイルス剤）と各作業セッションの後に....
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ディスカッション
研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下での様々な環境下で結核 。11月16日最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影響は、メタボローム解析が続くかもしれません。17,18いくつかの研究ではM内代謝経路を研究するためにこの方法論を利用してきました結核 （下記参照）と他のマイコバクテリア、Mのいずれかに感染したマウスにおける代謝の変化を分析する結核19
この方法論の潜在的な落とし穴は、試料中のいくつかの微生物が完全に溶解することがないかもしれないということです。必要であれば、溶解工程は、1つ以上を繰り返すことができます2回以上。溶解効率は、標準的なタン.......
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
著者らは、プロトコルを開発しながら有益なコメントを博士バルレッタ博士とパワーズの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。我々は、原稿の役立つ議論と校正のためにウェンディオースティンに感謝します。本稿で説明する作業は、ネブラスカ州リンカーンレドックス生物学センター（親助成＃NCRR 2P20RR 017675、D.ベッカー、PI）の大学から上記の各調査官にシードパイロット補助金によって賄われていた。加えて、我々は研究を供給し、このパブリケーションに含まNMR法を標準化するために、氏Halouskaの部分的な給与のサポートのために彼女のR21を助成（1R21AI087561-01A1）から資金を提供するための博士OFELIAチャコンに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬/機器の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 |
| ADCの充実 | BD BBLミドル | 212352 | |
| BACS-120サンプルチェンジャー | ブルカー | ||
| ブルカーアヴァンセNMR | ブルカー | 500 MHzの | |
| ウシ血清アルブミン | フィッシャー·サイエンティフィック | BP1600-100 | フラクションV |
| 遠心 | ベックマン·コールター | アレグラ、X-15R | ベンチトップ |
| 遠心管 | コーニング | 430291 | 50ミリリットル滅菌ポリプロピレン |
| クライオジェニックバイアル | コーニング | 430488 | 2.0ミリリットル滅菌ポリプロピレン |
| シクロヘキサンximide | AGの科学 | C-1189 | 毒性 |
| D（+） - グルコース | アクロス | 41095-0010 | |
| 酸化ジュウテリウム | シグマアルドリッチ | 617385 | |
| 三角フラスコ | VWR | 89095-266 | 滅菌、フラットベース、ポリカーボネート、0.22μmのPTFE膜ベントキャップ |
| フラッシュフリーズフラスコ | VWR | 82018-226 | 750ミリリットル |
| 凍結乾燥機 | VWR | 82019-038 | 4.5 Lのベンチ |
| グリセロール | ギブコBRL | 15514-029 | |
| インキュベーター | ニューブランズウィック州 | イノーバ40 | ベンチシェーカー |
| 行列Bを溶解 | MPバイオメディカル | 6911-100 | |
| 溶解機 | MPバイオメディカル | FastPrep-24 | |
| 遠心 | エッペンドルフ | 5415D | ベンチトップ |
| 遠心 | ベックマン·コールター | 微量22R | ベンチトップ |
| ミドル7H9ブロス | ディフコ | 271310 | |
| NMR管 | ノレル | ST500-7 | 5mMの |
| OADC濃縮 | BD BBLミドル | 212351 | |
| オレイン酸 | シグマ | O1008 | |
| リン酸二カリウム | VWR | BDH0266 | |
| リン酸二水素カリウム | VWR | BDH0268 | |
| ローター - 微量22R | ベックマン·コールター | F241.5P | 密封されたとポリプロピレン |
| ローター - アレグラX-15R | ベックマン·コールター | SX4750 | バイオ認定のカバー付き |
| 塩化ナトリウム | フィッシャー·サイエンティフィック | S271-3 | |
| ナトリウム3 - トリメチルシリル-2,2,3,3-D4 | ケンブリッジアイソトープ | DLM-48 | |
| 分光光度計 | ベックマン·コールター | DU-530 | |
| 分光光度計のキュベット | 命綱 | LS-2410 | 1.5 mlのポリスチレン、2明確な側面 |
| 注射器 | ベクトン·ディッキンソン | 309585 | 滅菌、3ミリリットルルアー |
| シリンジフィルター | ナルゲン | 190-2520 | 0.2μmの無菌酢酸セルロース |
| ツイーン80 | フィッシャー·サイエンティフィック | BP338-500 |
参考文献
- Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2(2007).
- Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol<....
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