方法論記事

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

DOI：

10.3791/3686

⸱

2012年1月3日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida

この記事について

サマリー

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このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。

要約

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ABの毒素は、酵素サブユニットと細胞結合Bサブユニット1で構成されています。これらの毒素は、細胞外環境に分泌されますが、真核生物の細胞質ゾル内のターゲットに作用している。いくつかのAB毒素の細胞表面から細胞質ゾル2-4を入力する前に、小胞体（ER）への小胞のキャリアで旅行。 ERで、毒素や動きの残りの部分から蛋白質導電性チャネルを介して触媒鎖の解離は、その細胞質ターゲット5に到達する。ほとんどの内部化毒素を分解するリソソームにルーティングされるので、表面に結合した毒素のほんの一部はゴルジ装置や小胞体6に達する：ERへの毒素の人身売買は非常に非効率的なプロセスであるため、転、細胞質ゾルのチェーンは検出が困難です。 -12。

ERからの培養細胞の細胞質ゾルへの毒素の移行を監視するには、我々はhighlと細胞下分画のプロトコルを組み合わせて表面プラズモン共鳴（SPR）13から15のy感度な検出方法。毒素処理細胞の形質膜を選択的に続いて抗毒素鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流サイトゾル画分の収集を可能にする、ジギトニン透過化されています。抗体でコーティングされたセンサーは、細胞質毒素のpg / mLの量をキャプチャし、検出することができます。このプロトコルで、それは細胞質ゾルへの毒素のエントリの動態を追跡すると、転座のイベントの抑制効果を評価することも可能です。細胞質毒素の濃度は、センサを介して灌流されているチェーンの規格の既知の量で生成された標準曲線から計算することができます。私たちの方法は、放射性標識またはターゲットの毒素に他の変更を必要としない迅速、高感度、および定量的な検出システムを表します。

プロトコル

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1。ジギトニンの準備

  1. マイクロ遠心チューブに100％エタノールを500μLを追加し、80℃で10分間に設定されているヒートブロックに配置します。
  2. ジギトニンの1％のストック溶液を生成するために加熱されたエタノールを250μLにジギトニンの2.5 mgを溶解する。
  3. 0.04％ジギトニンの実用的なソリューションを生成するには、HCN緩衝液（50mMのHepes pH7.5の、150mMのNaCl、2mMのCaCl 2を 、10mMのN -エチルマレイミド、およびプロテアーゼ阻害剤の960μLにジギトニンストック溶液40μLを追加するカクテル）。

2。セルの中毒と透過

私たちの相互転座試験、毒素や細胞株の範囲に適用することができます。以下に、我々は、コレラ毒素（CT）を検出するための詳細なプロトコルを提供しています。手順の概要を図1に提供されています。

  1. HeLa細胞を10％ウシ胎児血清と抗生物質 - 抗真菌剤を添加した1mlのDMEMを含む6ウェルプレートに播種されています37 /ウェルで一晩インキュベーション後1 × 10 6細胞℃を達成するために十分な再現性の検出のための細胞質毒素を生成するには、3つのウェルは、各条件のために必要とされています。
  2. 一晩インキュベートした後、1 mLのDMEMがガングリオシドGM1の100 ng / mLを含有する培地を交換してください。 CTのGM1受容体はGM1の解決に曝露した細胞の形質膜へのインターカレートされるので、これは、CTの結合部位の数が増えます。
  3. 37℃1時間のインキュベーション後° C、GM1含有培地を除去し、DMEMで細胞を2回洗浄する。その後、4℃で細胞を配置· CTの1μg/ mLを含む1 mLのDMEMで30分間を。
  4. 37、毒素含有培地を除去DMEMで細胞を2回洗浄し、1 mLのDMEMで細胞をインキュベートします希望の時間間隔（秒）のためのC。
  5. 各追跡期間の終了時に、PBSで細胞を洗浄し、PBS中の0.5 mMのEDTA 250μLを各ウェルをインキュベートする。細胞は10分間放置室温で分してから、P1000 pipetmanで積極的な粉砕によって6 - ウェルプレートからそれらを削除します。細胞の1つのウェルが収集された後は、よく同じ状態から2番目と3番目とそれを組み合わせる。セルスクレーパーはまた、細胞を収集するために使用することができます。
  6. 単一のマイクロ遠心チューブに3つの繰り返し井戸（750μL、総容積）から結合細胞懸濁液を置き、5,000 x gで5分間卓上型マイクロでそれを回転させるほぼ同等の大きさの細胞ペレットを、すべての条件のために取得する必要があります。
  7. 上清を捨て、ジギトニンの0.04％ワーキング溶液100μLで細胞ペレットを再懸濁します。氷上で10分間細胞懸濁液を置きます。
  8. 卓上微量遠心機で10分間、16,000 xgでジギトニン透過性細胞をスピン。新鮮なマイクロ遠心チューブに細胞質を含む​​上清画分を転送し、細胞小器官を含むペレット画分を保持する。
タイトル"> 3。サンプルの準備
  1. 細胞質ゾルを含む上清画分を1mLの最終容量にHCN緩衝液で希釈されています。少なくとも1 mLのサンプル容量は、空気を注入する前に500μLのサンプルループからパージされることを保証するために必要です。
  2. オルガネラ含有ペレット画分を1％トリトンX - 100を含むHCN緩衝液1 mLに再懸濁する。界面活性剤の添加は、膜の箱に入った毒素のプールを解放するために必要です。
  3. 100の濃度は、10、1、0.1 ng / mLので毒素の基準は、HCNのバッファーで調製される。
  4. 細胞質やオルガネラ分画のパラレルセットは、分画操作の忠実度を確認するために、対照実験のために準備されています。第2節で説明したように生成された画分を4倍速サンプル緩衝液（サイトゾル画分）または1xサンプルバッファー（オルガネラ分画）120μLの20μLに再懸濁する。各画分の相当するボリュームは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、bをプローブしている上清画分の細胞質タンパク質とペレット画分16から19に可溶、常駐ERタンパク質のパーティショニングを実証するためにyをウェスタンブロット分析。

4。 SPRのスライドの準備

  1. ライヘルトSR7000 SPR屈折計は、SPRの実験のために使用されます。
  2. SPR測定器で自己組織化単分子膜と金メッキのガラススライドを設定します。 41μL/ minの流速で10分間、スライド上に0.4 M EDCおよび0.1MのNHSのソリューション：センサのスライドを有効にするには、1:1（V V）を灌流。後続のすべてのperfusionsは同じ流速を使用します。
  3. EDC削除するには：NHS活性化バッファを、PBS、0.05％ツイーン20（PBST）を含むと5分間プレートを洗浄する。 NHS溶液：プレートはEDCによってuncappingに起因する反応性アミドテザーが含まれています。
  4. 15分間20mMの酢酸ナトリウム（pH 5.5）で1:20,000の希釈で活性化さセンサーのスライドを介して抗CTA抗体を灌流。の屈折率の初期ドロップDEXユニット（RIU）はpH変化により発生されます。抗体がセンサーのスライド上でアミド反応性テザーによって捕捉されるため、これはRIUの増加が続きます。
  5. 5分のPBST洗浄とセンサーのスライドから未結合の抗体を取り外します。捕捉抗体によって生成RIUの信号は、高原と安定化は、新しい基準信号を提供します。
  6. 5分間センサースライド上の灌流1 Mエタノールアミン（pH 8.5）で。このキャップとセンサのスライド上に残っている未結合のテザーを不活性化する。

5。サンプルのSPR分析

  1. ベースライン値、5分間抗体でコーティングされたセンサーで散らすPBSTを確立する。
  2. 300秒のためのセンサーで実験サンプルや毒素の標準を灌流。別の200秒のためのセンサー上でバッファと浸み込ませるのPBSTから配位子を削除します。
  3. 各灌流に続いて、結合した毒素は、pH5.0でPBSTで100秒の洗浄で、センサから削除されます。これは、信号を返します。その初期のベースライン値に、このように別のサンプルが同じセンサーで処理することができます。
  4. 新しいサンプルをロードする前に、前のサンプルからの残留流体を排出するためのサンプルループを介して少量の空気を押してください。 5.2から5.4に概説した手順を使用して、我々は、ベースラインの信号を実質的に失うことなく、あるスライドで12サンプルまでに実行した。
  5. データ分析は、スクラバー2ソフトウェアで実行され、イゴールのソフトウェアは、図の準備のために使用されます。

6。代表的な結果

百日咳毒素（PT）は、そのチェーンの前に細胞表面からERに移動するAB毒素である（PTS1）細胞質ゾル3、12を入力します。図2に示すように、私たちのSPRベースの相互転座試験では、酔ってCHO細胞の細胞質ゾルでPTS1を検出することができた。シグナルは抗PTS1抗体は、宿主の細胞質ゾルの成分と交差反応しなかったが確認unintoxicated細胞、の細胞質から生成されませんでした。市販ブレフェルジンA（BFA）の存在下で酔って細胞からのサイトゾル画分にも肯定的な信号を生み出すことができなかった。 BFAは、ERの転座部位6-8、12、20から25と、このように、細胞質ゾルへのチェーンの配信に毒素の輸送を防ぐことができます。各実行の最後に、結合した毒素は、センサーのスライドから除去されます。この許可された複数のサンプルは、1つのセンサーのスライド上でスクリーニングし、それによって、異なる実験条件で得られた結果との間の直接比較を提供する。

CTは、別のAB型、ER -転位毒素4です。図3Aに、CTA1はCT処理したHeLa細胞から細胞質画分に検出された。これは私たちの方法論が複数の細胞型で動作すると抗鎖抗体が利用できる任意の毒素にも適用できることを強調した。細胞はこのようにそのCTA1を示す、抗CTB抗体（図3B）でコーティングしたSPRセンサー上灌流したときにサイトゾル画分CT -治療からの信号は検出されなかったサブユニットは、セル結合CTB量体は、細胞質ゾルに入るではない。図3Cは、細胞小器官の分画からの信号がサイトゾル画分からの弱い信号に比べてオフスケールであることを示しています。これは、順番に細胞質に達することができる毒素の量を制限するER転座のサイト6、7、へCT輸送の既知の非効率性と一致していた。さらに、細胞小器官の分画はCTのholotoxinだけでなく、小胞体に局在CTA1が含まれているので、オルガネラ分画のための結果のSPR信号がholotoxin関連CTB量体の付加質量だけ膨らみます。従って、それは同じセンサーグラムで細胞小器官と細胞質分画からのデータをプロットするのは実用的ではありません。

私たちのアッセイは、転、細胞質毒素（図4）の時間依存蓄積を監視することができます。細胞を4でCTに暴露した° C、形質膜への毒素の結合が可能ですが、セルに関連した毒素の内在化を防止する温度。サンレモ後に非結合毒素のvalは、細胞を37℃に加温したERへの毒素の輸送および細胞質ゾルへのチェーンの転座の両方が、この温度で​​発生する可能性があります。いいえ毒素は、温暖化後の37℃に細胞質ゾル、15分で検出されなかったこれは、ERから（i）holotoxinの人身売買に必要な遅延時間を反映して、ERで（II）/ Bサブユニットの解離、および細胞質ゾルへの（iii）のチェーンの輸出。細胞質毒素のマイナーなプールは、Cは37℃で30分後に検出された、および細胞質毒素の漸進的に数量が多い場合は、45〜60分の追跡間隔の後に検出された。細胞質毒素の一層のレベルは、このように宿主の細胞質に細胞関連毒素の継続的、長期的な配信を実証、5時間追跡間隔の17日以降に検出された。

私たちのアッセイはまた、細胞質ゾルへの毒素の移行の阻害（図5）を検出することができます。 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、熱disordを防ぐ化学シャペロンによる治療を受けた細胞孤立CTA1サブユニット（T. BanerjeeさんとK. Teter、未発表の観察）のering、未処理の対照細胞と比較して細胞質CTA1の低いレベルを示した。毒素の展開のチェーンは、細胞質ゾル16から18へ移行するための前提条件である、CTA1のDMSO誘発性安定化がそれに応じて小胞体からサ ​​イトゾルへの動きを妨げるので。

SPRの実験から計算された会合速度定数（k a）は灌流バッファ14、15、26のリガンドの濃度に正比例する。従って、それは毒素の濃度の関数としての毒素の基準値kのプロットそのグラフから細胞質毒素の濃度を決定することが可能である。この手順は、図5に示した毒素の転座のDMSO誘発性ブロックを定量化するために使用されていました：毒素の既知濃度から作成した標準曲線は、細胞質CTA1 concentratを計算するために使用された未処理細胞とDMSO処理細胞（図6）は0.1 ng / mLの0.3 ng / mLのイオン。 DMSOによるアンフォールディングCTA1の阻害は、このようにCTA1のERから細胞質に転座の3倍の減少を生成する。

figure-protocol-1
図1。プロトコルの概要。 （A）、細胞を4℃AB毒素° C、細胞表面に毒素が結合できるようですが毒素のエンドサイトーシスを防止する温度でインキュベートする。毒素のAとBサブユニットはそれぞれ、赤と青の円で表されます。 （B）非結合毒素を培地から除去し、細胞を℃にERにholotoxinのエンドサイトーシスと逆行輸送を促進するために37に加温している。 Holotoxin解離、分離された鎖はER膜内のタンパク質伝導チャネル（S）を通過させることによって細胞質ゾルを入力できるようにERで発生します。 （C）細胞は選択的にプラズマを透過するために、ジギトニンで処理されています膜。 （D）遠心分離は、細胞別の細胞質やオルガネラ画分に分割するために使用されます。細胞質ゾルはジギトニンで生成された孔を通って細胞外に絞られており、上清に位置しています。そのまま、膜結合小器官は、ペレット画分に見出される。 （E）宿主細胞質内毒素チェーンの転プールを検出するために、上清画分を抗鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流される。

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図2ホストの細胞質ゾルへのPTS1転座の検出。 CHO細胞はパルスラベル4℃PTの1μg/ mLの30分間でした。次に、細胞を37℃で3時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラや細胞質fractiにパーティションのセルの抽出に使用されていましたアドオン。抗PTS1抗体で被覆したSPRセンサーは、未処理またはBFA処理細胞からPTS1の細胞質プールを検出するために使用されていました。 unintoxicated細胞からのサイトゾル画分をネガティブコントロールとして、センサのスライドを介して灌流しながらPTS1基準は、ポジティブコントロールとして、センサを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。

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図3。宿主の細胞質ゾルへのCTA1転座の検出。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラと細胞質分画にパーティションのセルの抽出に使用されていました。 （A）細胞質ゾル画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。知られてunintoxicated細胞から細胞質ゾルをネガティブコントロールとして使用されていた間にCTAの量は、陽性対照として使用した。 （B）BFAの存在下で酔って、細胞から細胞質画分を抗CTB抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。精製したCTB量体は、ポジティブコントロールとしてスライド上に灌流した。 （C）オルガネラの分画を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサーで灌流する前に、1％トリトンX - 100で可溶化した。比較のため、同一の細胞抽出物およびCTAの標準からのサイトゾル画分（1mlの最終容量）もセンサの上に灌流した。すべてのパネルの場合は、バインドされたサンプルは、各実行の終了時に、センサから除去した。

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図4。細胞質ゾルへのCTA1エントリの速度論。毒素のない視野に入っにおけるHeLa細胞パルス標識4℃CTの1​​μg/ mlのCが15、30、45、または37℃で60分間追われた° CM.毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は、同様にセンサーを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。

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図5。DMSOによるCTA1転座を阻害する。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または10％DMSOを（+ DMSO酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は（100、10、1、0.1 ng / mL）を陽性対照として、センサを介して灌流した。わずか1〜0.1 ng / mLの標準は、スケーリングの目的のために示されている。 unintoxicateから細胞質ゾルD細胞は、陰性対照として使用した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。

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図6。細胞質CTA1の計算は、図5からCTAの基準値k個の毒素の濃度の関数としてプロットした。結果として得られる標準曲線は 、k図5に、未処理とDMSO処理細胞における細胞質CTA1の濃度から実験試料の値に基づいて、決定するために使用されていました。未処理細胞質ゾルは、オープンの正方形として表示されます;毒素の基準が満たされた円として提示され、DMSO処理細胞質ゾルは白丸として表示されます。平均± 2つの独立した実験の範囲が示されています。

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ディスカッション

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既存の手法との比較

私たちのSPRベースの相互転座試験では、ホストの細胞質ゾル中に毒素の配信を検出するための迅速、高感度、および定量的なメソッドを表します。手法は、毒素に放射性標識または他の変更を必要としない、それは抗毒素鎖抗体が利用できる任意の毒素に適用することができます。細胞質ゾルへの毒素の通過を監視するために既存の方法はまた別の細胞質ゾルと膜画11、23、27、28に分割する細胞抽出物の細胞下分画のプロトコルに依存しています。これらのメソッドは、毒素の細胞質プールを検出するためにウエスタンブロットあるいは放射性標識を使用してください。前者のアプローチは、最高の状態で半定量的であり、相対的に貧しい感受性に苦しんでいる。であっても放射標識プロトコルはにより細胞質に到達する毒素の低レベルに、結果を生成するために数週間かかることがあります。放射性標識毒素との定量分析は、相対的な割合を決定することができますが細胞質ゾルに入る細胞関連毒素が、このアプローチは、直接細胞質毒素分子の正確な数を判断することはできません。放射性標識毒素の検出にSPRの毒素検出の感度を比較すると、...

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開示事項

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利害の衝突は宣言されません。

謝辞

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この作品は、K. TeterにNIHの助成R01 AI073783によって賄われていた。私たちは、原稿の重要な読書のための細胞下分画プロトコルとヘレンBurressの開発の支援のために博士シェーンマッシーに感謝。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号
ジギトニンシグマ D141
エタノールアクロス 61509-0010
DMEM インビトロジェン 11995065
ウシ胎仔血清アトランタバイオ S11550
ガングリオシドGM1 シグマ G7641
CTA シグマ C2398
PTS1 一覧 182
NHS（N -ヒドロキシスクシンイミド） ピアース 24500
EDC（1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド） サーモサイエンティフィック 22981
エタノールアミン SiのGMA E0135
PBST ウマゴヤシ属 09-8903-100
抗CTAの抗体サンタクルスバイオテクノロジー SC - 80747
抗CTB抗体カルビオケム 227040
抗PTS1抗体サンタクルスバイオテクノロジー SC - 57639
屈折計ライヘルト SR7000、SR7000DC
SPRセンサのスライドライヘルト 13206060
注射器ポンプコー​​ルパーマー 780200C

参考文献

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