アポトーシスの早期発見は病気の様々なリスクの高い細胞集団を識別することができる。ここでは、MRIで検出可能な酸化鉄ナノ粒子（SPIO）に初期アポトーシス検出タンパク質（アネキシンV）にリンクする方法を示しています。このメソッドは、MRIで検出可能な分子イメージングプローブを生成するために関心のある他のタンパク質に延長することができる。
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この記事について
サマリー
要約
細胞のアポトーシスは、多くの疾患の顕著な特徴であり、疾患の臨床症状が明らかになる前にこのプログラム細胞死は、通常発生します。その初期、可逆段階でアポトーシスを検出する手段が予防または治療措置が永久的な損傷から心臓を保護するために取ることができる、その間に前臨床試験 'ウィンドウを'余裕でしょう。我々はここにMRIで検出可能な造影剤として機能する超常磁性酸化鉄（SPIO）粒子に熱心にアポトーシスの最も初期の、可逆的な段階で細胞に結合するヒトアネキシンV（ANX）を、共役するためのシンプルかつ堅牢な方法を提示する。接合方法は、SPIOの多糖類のシェルにカルボキシル基を酸化しSPIOナノ粒子の酸化で始まります。 ANXタンパク質を精製した後の削減バッファにSPIOとANXの共有結合性相互作用を容易にするために、ホウ酸ナトリウム溶液の設定で追加されます。ナトリウムborohydrid最終的な還元工程eは削減を完了するために実行され、その後反応がクエンチされる。非抱合ANXは、遠心濾過により混合物から除去されます。 ANX-SPIO製品のサイズと純度は、動的光散乱（DLS）によって検証されます。このメソッドは、架橋された酸化鉄粒子の共役メソッドまたはビオチン標識ナノ粒子とは対照的に、への追加を必要とする、または多糖類SPIOシェルの変更はありません。結果として、このメソッドは、興味のある他のタンパク質の結合に延長することができる、シンプルで堅牢なアプローチを表しています。
プロトコル
事前調査1から適応した。
1。 SPIOのアネキシンVの結合
- 2：0.15 M過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素4）（重量比4:1の重量）と溶液中で暗所で20℃で1時間SPIO粒子（オーシャンナノテク社は、5 mg / mL）を°Cを酸化させる。
- 20℃で0.15 Mホウ酸ナトリウムた（Na 2 B 4 O 7 10H 2 O）で：ANXタンパク質を（重量比1:1、重量）を精製して12時間酸化SPIOをインキュベート
- ヒュームフードの下水素化ホウ素ナトリウム（NaBH 4の ）で1時間さらに混合物を削減し、その後、0.15Mトリス-HClで急冷する。
- 14,000×gで（75μmの細孔マイクロコンフィルターミリポア、ビルリカ、MA）で遠心分離してANX-SPIOから無料でANXを分離します。
- さらに磁気分離装置（オーシャンナノテク、（株））を使用してバインドされていない不純物を除去することによって化合物を絞り込む。
- フィルター残留（ANX-SPIO）タンパク質レベルを定量化する-80 Bradfordタンパク質アッセイ、店舗によって2℃で1％血清アルブミンおよびプロテアーゼ阻害剤（HALTプロテ....
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ディスカッション
アネキシンVにSPIOをリンクするための説明した接合方法は、アネキシンとSPIOナノ粒子のカルボキシル部分の側鎖アミン基を利用しています。特定の酸化還元工程を経て、これらの化合物の共有結合を達成することができ、得られた官能性ナノ粒子を単離することができる。このメソッドは、興味のある他のタンパク質とナノ粒子に一般化することができる。
最も重要な手順は、酸化還元条件である適切な温度にして穏やかに混合しながら行った。低収率は、ろ過工程中に除去される残留遊離アネキシンVは、その結果、不完全な酸化または還元から発生する可能性があります。興味のある他のタンパク質に適用した場合、最適な条件は、上記のものと異なる場合があります。しかし、一度それらの最適な条件が定義されている、フィルタリングフリータンパク質はごくわずかに減少し、したがって、遠心ろ過メートルがありますAYは不要になります。確かに、過剰ろ過はフィルター自体への非特異的結合のために最終的な化合物の収率を減らすことができます。この問題が発生した場合、フィルタを介してアルブミン1％を事前にフィルタリングフィルタに共役化合物の非特異的結合を低減.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
国立衛生研究所、NHLBI（RD、PY、PS）。
米国心臓協会（JL）。
スタンフォード大学、VPUEグラント（JL）。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ＃ | |
| 超常磁性酸化鉄 | オーシャンナノテク株式会社 | ICK-40から005 | |
| ドキソルビシン | シグマ | D1515-10mgの | |
| セパレータをSuperMag | オーシャンナノテク株式会社 | N / A | |
| ゼータサイザーナノDLSマシン | マルバーン社 | N / A |
参考文献
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate. Biochemistry. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu,....
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再版と許可
