糖尿病ラットの熱侵害受容閾値の迅速定量

サマリー

ここでは、ラットやマウスはnocifensive動作を示している最低温度を決定するための迅速な信頼性と簡単な手順を説明し、つまり、熱侵害受容閾値（TNT）。このメソッドは、動物への最低限のがあれば、ストレスTNTsの正確で再現性の推定を可能に徐々に増加し熱刺激を適用します。

要約

痛みを伴う糖尿病性神経障害（PDN）は、通常無害な刺激を¹に痛覚過敏すなわち 、有害な刺激に対する感受性の増加、および異痛症、すなわち過敏症によって特徴付けられる。痛覚過敏とアロディニアは、糖尿病²のさまざまな齧歯類モデルで研究されている。しかし、Bölcskei ら 、動物モデルでの" 痛み "の決定で述べたように、その主観的性質³のために挑戦されています。また、有害な熱刺激に対する行動反応を決定するために使用される伝統的な方法は、通常、再現性および薬理学的感度^3を欠いている。例えば、Ankier ⁴のホットプレート法を用いて、尻込み、引きこもり、そして/または、どちら後肢および/ ​​またはフォア足の舐めは、一定の高い熱刺激（52から55℃）で反射潜時のように定量化されます。しかし、熱刺激に対する痛覚過敏な動物では、再現性の違いを再表示されませんそれらの閾上温度^3,5を使用^してFlexの待ち時間。 Bölcskei らの最近記載の方法^。6として、手順はここで説明したマウスとラットの熱侵害受容閾値（TNTs）の迅速、高感度で再現性の測定を可能にします。メソッドは、マウス/ラットの足底表面の皮膚に主に適用され徐々に増加し熱刺激を使用しています。メソッドは、PDNとして痛覚過敏状態の間、抗侵害受容を研究するために特に敏感である。怒鳴る説明する手順は、Almási ら ^5Bölcskei ら ³で詳細に公開されたものに基づいています。ここで説明する手順は、実験動物のケアを承認し、委員会（LACUC）、ライト州立大学を使用しています。

プロトコル

マウスとラットのTNTsは、増分ホットプレート鎮痛メーター[iHPAM、IITC株式会社ライフサイエンス（ウッドランドヒルズ、カリフォルニア州）]を使用することによって決定されます。上記の下に暖房システムのアルミプレート（10×20 cm）とプレキシグラス観測室、熱制御部、データ集録（IITCパーツ＃ソフトシリーズ8）のソフトウェア、（個人PC：装置は、複数のコンポーネントで構成されコンピューター）とリモートスタートのフットスイッチは、ユニットの制御を停止したり、リセットします。加熱システムは、機器の前面のキーパッドを使用して手動で加熱プロセスの起動/停止/リセットできます。 iHPAMは、様々な加熱速度、スタンバイ/オフ温度に設定することができます。

1。機器のセットアップ

1. 動物をテストする前に、視覚的に選択された昇温速度（ 例えば 、6°C /分）、最初のスタンバイと最後のカットオフ温度（ 例えば 、28°Cと55それぞれ°C）、確証するためにユニットを点検します。
2. すべての接続を確認します。結果の電子コピーを維持するために、ユニットがソフトウェアシリーズ8を実行しているコンピュータに接続する必要があります。また、結果のハードコピーは、ユニットのシリアルポートを介して印刷することができます。
3. 機器をテストします。最初のスタンバイ、最後のカット​​温度とカットオフ温度に到達するために必要な時間（秒単位）：ソフトウェアシリーズ8レコードがデータを確認するために一度フットスイッチを押してください。
4. さらに、対照試験として、実験に関わる研究者は自分自身でデバイスを経験する必要があります。痛み知覚の瞬間（46-48℃）で金属板から手を撤回することも肌に害を及ぼさないも、それ以降の不快感を生成する必要があります。
5. ユニットがセットされ、ステップ1.3と1.4の結果が記録されていたら、それらを比較することができます。これは、ユニットの使用を無効にする可能性のある潜在的な問題を検出すると便利です。例えば、最初の最後のスタンバイ/カットオフテンペの間の不一致raturesと実際のユニットの読み取り、および/またはユニットと手撤退に必要な実際のプレート温度で表示される温度の違い。

2。正常な動物のテスト

任意の遺伝的背景や性別のいずれか若い大人Wistarラット[産後（P）年齢21から25日間]、またはマウス（P21-25）を使用することができる。私たちの実験で用いたマウスは、ひずみC57BL/6Jのものです。

1. 実験を実行する前の晩、iHPAMが配置されているベンチに彼らのケージを置くことによって、動物を順応させる。テストを実行する前に2時間、ユニットのバックグラウンドノイズを持つ動物を理解するためにiHPAMをオンにします。この時点で、iHPAMを設定し、（ステップ1を参照 ）、適切な機能を検証するためにテストすることができます。食料と水は、動物（ステップ2.1 参照 ）の観測室にある場合を除いて、試験全体で広告を自由に提供されています。
   注：IMPで行動実験における実験条件は、デフォルトで制御されていることを前提としないortant。特別な注意が行動の研究^（7日 ）の結果に影響を与える可能性がある遺伝的要因と環境要因に支払わなければなりません。
2. 静かに装置の加熱板の上にプレキシガラス観測室における通常のマウス/ラットを配置します。動物が快適な動作が表示されるまで動物が温め表面温度（℃28℃設定）に順応することができます。
   注：この条件下では正常成体ラットのスニッフィングながら、時折観察チャンバーの蓋に向かって立って、最初の探索行動を示しています。数分後、ラットは、グルーミングのカジュアルな発作とリラックスした挙動を示す可能性があります。さりげなく周囲を嗅ぎながら、時には、ラットはリラックスした身体の姿勢（しやすい拡張子）で横たわっていた。通常のマウスには、通常のラットよりもアクティブになっています。しかし、マウスは、私が数分後にリラックスした探索行動を示す観察室をnである。エスケープ行動（ 例えば 、観察室から脱出しようとすると、ジャンプ）や守備的な態度（ 例えば 、キーンという音）のいずれかを観察するために非常に稀である。マウスは、マウスを一回から別の⁸に痛みを伝えることができることに注意することも重要です。したがって、それは別のケージに置かれたマウスをテストすることが重要かもしれません。
3. すべての角度で観測を可能にするために、観測室の後ろにミラーを配置します。デジタルビデオカメラを保持している三脚はnocifensive（痛みは避けること）の動作が発生したときの正確な瞬間を決定する助けになるかもしれません。
4. 一度動物がフットスイッチを押すことによって、プレート上の観測室の熱で快適です。プレートの温度が6℃/分の速度でヒートアップする場合は、通常の動物は、いずれかの後肢足を含むnocifensive挙動を示す46から48°C ^3,5,9,10に荒れ狂う*通常の温度。したがって、動物はobserv典型的な削除フォームです。約3分後にation室。
   注：振とうしながら、舐める後肢足、ラットやマウス、すなわち典型的なnocifensive応答を観察し、そして/またはリフトは、熱刺激を終了するのに十分です。これは、フットスイッチを押すことによって達成されます。この時点で、ソフトウェアは、プレートの温度を記録し、プレートはすぐにスタンバイ温度（28℃）まで冷却する（〜0.5分）に達しています。この温度すなわち 、任意のnocifensive反応を呼び起こすものが通常の（コントロール）動物の有害な熱のしきい値（TNT）と見なされます。
   *場合によっては、特にマウスでは、有害な温度にnocifensive動作は最初の1つまたは両方の前足（ 例えば 、座って舐める）で観察することができ、数秒後肢足前。しかし、フォア足舐めはグルーミング行動の正常なコンポーネントです。したがって、唯一の後肢足反応が評価されています。機会マウスだけでなく彼らの後肢足をグルーミング可能性があります。しかし、通常のグルーミングは、nを行う数秒以上続くOT、なめて集中的に関与しないと、通常、その爪を洗浄した後終了します。
5. 静かにプレートから動物を削除し、それぞれのケージに入れてください。熱のしきい値の測定は、他のコントロール（正常な）動物に対して繰り返されます。
   注：TNTsは観察室から動物を削除せずに1〜2分間隔で単一の動物で決定することができます。ラットやマウスでTNTの決定は、数日中に数回繰り返すことができます。これは、個々の動物と同様に年齢とともに、その変動の平均TNTを決定する場合に特に便利です。
6. 対照動物のTNTは、3つ以上のしきい値の平均±SEMとして表されます。
7. 得られたデータの統計分析は、マウスやラットの異なる治療群を比較するために実行されます。データが正規分布している場所と治療群ではホモどこ分散分析を含むパラメトリック手順が適切に使用することができskedastic、これらの条件は、次のアプローチを適用することができ満足しています。複数の測定、すなわちの違いを検出するために、ニューマン·クールズ検定に続く分散分析は、治療せずに、または別の時点（ 例えば、 図3のデータ）で/で個々のTNTsを繰り返した。ペアスチューデント t-検定は、2つのデータグループ、すなわち 、薬物治療後の対前TNTsを比較するために使用されるかもしれません。t-検定対は、車両処理動物（ 例えば対薬物治療におけるTNTの変化の違いを決定するために用いることができる、 図4のデータ）。

3。糖尿病動物のテスト

ストレプトゾトシン（STZ）誘発糖尿病ラットでは、PDNのメカニズムを研究し、鎮痛薬や治療法^11,12を評価する最も一般的に使用される動物モデルである。ラットはSTZの単回腹腔内投与（60 mg / kg）の缶bによって糖尿病を作ったeは、糖尿病¹¹の発症後第³週の間に熱痛覚過敏のためにテストされています。すべての糖尿病ラットはPDNを開発することに注意することは重要です。しかし、痛覚過敏を（〜50％）を開発しない動物が容易に識別することができます。確かに、彼らのTNTsは、通常の*よりも低い。

* 15の開始プレートの温度をSTZ-糖尿病ラットのTNTsを判別するには°Cの代わりに、28°Cが使用されます。これらの変更の理由は、PDNで最も糖尿病の動物は^2,11痛覚過敏になると予想されます。したがって、彼らは通常の有害な熱のしきい値より低くなければなりません（ 例えば、<45°C）。

1. 糖尿病ラットは、試験装置の上に観測室に配置されます。動物は、動物が快適な動作が表示されるまでプレートの表面に順応するために許可されています。
   注：通常、糖尿病ラットは正常な動作の多くが表示されません。糖尿病ラットでは、無気力、通常減弱であり、頻繁に表示制限された動きをゆっくりとグルーミング。それは、観測室の蓋に向かって順位を観察することは稀である。数分後に、糖尿病ラットは冷静にカジュアルな周囲のスニッフィングと室の隅に残ることがあります。
2. 糖尿病の動物が観察室で快適になると糖尿病ラットは後肢/フォア·足のいずれかを含むnocifensive現象が発生することがありますステップ2.3のように、プレートは加熱されています。これは通常、非有害なプレート温度（ 例えば 、<45°C）において、または6℃/ minで温度上昇したチャンバー内では5分後に発生します。
   注：若い成人の糖尿病ラットのnocifensive応答は正常ラットのそれとは異なることはありません。しかし、このような行動を喚起する最低温度が著しく低下します。
3. ステップ2.4​​を参照してください。
4. 実験の日以上の3つのしきい値の平均値は°C±SEMはdiabetiの有害な熱のしきい値とみなされますように表さcの動物。
   注：同様のパラダイム正常または糖尿病ラットで説明したものには、熱しきい値の鎮痛剤の熱反nocifensive効果を決定するために追跡することができる。

4。テスト鎮痛

薬の抗侵害受容特性（ 例えば、鎮痛薬）と同様に、最小有効用量として薬理学的パラメータの決定が容易に上述した手順を使用して取得することができます。それはラット/マウスに投与した鎮痛薬の適切な用量が大幅にTNTsを増加させるだろうと予測されています。これは、温熱性痛覚過敏³動物に特に敏感である。しかし、結果の解釈にバイアスを避けるために、動物の群の行動観察に関わる研究者は知っているかに注意して動物が扱われていた場合、またはしないことはできません。さらに、観察者によって注入する薬剤は、他の研究者によって準備され、標識されていてもよいA、B、Cなど投与量は同定され、動物ごとに個々の用量を一覧表示、プリントアウトで提供されています。

テストされている薬剤に応じて、潜在的な鎮痛剤の異なる投与量が正常または糖尿病の動物は5-15分前に行動テストに投与することができる。適切なコントロールが含まれている（ すなわち、スタンドアロン、および/ ​​または糖尿病ラットPDNせずに車両を注入した年齢をマッチさせた動物）と（ 例えば、プレートと同じ開始温度）は、同じ条件を用いてテストする必要があります。薬の慢性影響も同様にテストすることができます。

5。代表的な結果

若い成人の正常な非投与ラットやマウスの後肢足のいずれかでnocifensive反応を喚起最低プレート温度は、ステップ2-1〜2-6を決定した。 図1に示すように、通常の若い成人ラットとマウスのTNTは47.2であった±0.2℃、47.5±0.5℃であった。

我々はOBSEを持っている個人のTNTs（ 図2A）も同じ年齢の個体（ 図2B）の間でTNTsの重要な変更のrvedも重要な日常の変化。性別によるTNTの違い（ 図示せず ）が観察されなかった。

ヤングアダルトSTZ-糖尿病ラットのTNTsは、正常ラット（ステップ3.1から3.3）のと同様の方法で測定した。しかし、出発プレートの温度は15℃に設定したCの代わりに28℃のSTZ-糖尿病ラットのnocifensive動作は、個々に及び11日後にSTZ注射を開始し、毎日のファッションに少なくとも3回を評価した。 図3に示すように、STZ-糖尿病ラットのTNTの大幅な低下（p <0.01）が明らかに二週間後のSTZ注射になります。 STZ-糖尿病ラットのTNTは45.6±0.1°C（N = 16、14から23日からプールされた値）であったことを意味。

ノーマよりも有意に低いTNTを示す糖尿病ラットlはPDNを持っていると考えられた。これらのラットは、鎮痛剤の急性抗侵害受容特性（化合物）をテストするために使用された。 TNTs 5分のテストの前に単独化合物又は車両の単回投与のいずれかを注入し、正常および糖尿病ラットで測定した。車両単独（45.6°C 対 47.6°C、それぞれ）を投与したラットと比較した場合、 図4に示すように、化合物の単一の腹腔内投与量は有意に糖尿病ラットのTNTsを増加させた。化合物の抗nocifensive効果は、正常ラットで観察された;有意（p <0.01）、それはあまり顕著（47.4°C 対 48.0°C、それぞれ）であったものの、

図1。正常な若年成人のラットまたはマウスのTNTsの決定：若年成人ラット（P21-24）またはマウスのTNTs（P20-21）はABO概説した手順に従ってiHPAMで試験したVE。 12匹と25匹のマウスの合計がテストされました。測定は数日中に実行し、その結果をプールした。結果は平均値±SEMとして表されます。これらのラットに記録されている最小値と最大TNTの値は46.2°Cと48.6°Cそれぞれであった。マウスの場合には、記録された最大値と最小TNT値は、それぞれ、48.8°Cと44.9°Cであった。

図2。ラットおよびマウスのTNTsの年齢依存性：）プロットは5日の間に少なくとも1日3回決定21日齢の4正常ラット（n = 4）でのTNTsあるB）マウスのTNTsが示された時に一度決定同腹。年齢。各測定点の上に数字が使用される同腹子の数を表します。

図3。糖尿病ラットでは、我々は痛覚過敏3になる糖尿病の発症後EKS：6（n = 6）の時代にマッチヤングアダルトSTZ-糖尿病ラットのTNTsは11日、糖尿病の誘導後出発毎日測定した。示すように毎日のTNTの平均値（平均±SEM）である。 11から13日後のSTZ注射の間で決定糖尿病TNTsは正常範囲（赤線）内であった。 STZ注入TNTsは45.1に有意に減少した二週間後に±0.4°C、（P <0.05）。

図4。 STZ-糖尿病ラットにおける化合物Bの急性抗nocifensive効果。若年成人正常ラット（青群n = 12）と、年齢はSTZ-糖尿病痛覚過敏ラット（グリーングループはn = 6）車両の腹腔内注射した後iHPAMでテストされたマッチ（暗いバー）または化合物（ライトバー）。それぞれの治療（車両制御または化合物処理）の平均TNT±SEMを示す。アスタリスク（*）は、統計的な差異を示すた（p <0.05）。

ディスカッション

同様に、熱痛覚過敏^4,13を定量化するため^の典型的なホットプレート試験に、ここで説明する痛覚のアッセイは、ラットおよびマウスのnocifensive挙動を定量化するための高速かつ信頼性の高い方法を可能にします。しかし、古典的なテストに反し、増分ホットプレート法は、非侵襲的、実質的にストレスフリーです。いくつかの抑制（ すなわち 、動物は観察室である必要があります）テストを実行する必要があるが、ラットやマウスは、同様の分野（ 例えば 、住宅ケージ）に慣れています。

記載された条件下で、正常な若い成人ラットとマウスは、47℃の周囲温度でnocifensive挙動を示したこれらのしきい値は、他の研究者^3,5,13で報告されたものよりも若干高いですが、我々の結果は46から48の熱侵害受容閾値と一致している°C、人間¹⁴に観察され、サル¹⁵と他の動物モデル^10。差我々の研究からTNTsと^3,5,13公開さ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
名	会社	カタログ番号
増分ホットプレート鎮痛メーター	IITC（株）ライフサイエンス	パーツ＃PE34
ソフトシリーズ8	IITC（株）ライフサイエンス	パーツ＃Series8
ストレプトゾトシン	カルビオケム	572201