正常なヒト脳内の可溶性および不溶性のPrPオリゴマーの分離

サマリー

細胞プリオンタンパク質の新種（PRP ^C）は最近、ここで説明する方法を使用して、感染していない人間の脳で確認されています。そのうちのいくつかはまた、人間の脳から他のミスフォールドしたタンパク質凝集体を単離するのに有用であるが、これらの方法は、様々な種のPrPを単離することができる。

要約

プリオン病の病因において中心的なイベントには、その病原性のイソ型^の PrP Sc ¹にホストでエンコードされた細胞プリオンタンパク質PrP ^Cをの変換を伴う。 ^PrP Sc ^は界面活性剤不溶性の凝集体を形成し、PKの^2月6日に部分的に耐性であるのに対し、PrP ^Cのは 、界面活性剤可溶性およびプロテイナーゼK（PK）消化に敏感です。 ^PrP ScのためにPRP ^Cの変換はタンパク質のβシート構造へのα-ヘリックスの構造転移を伴うことが知られている。しかし、in vivo経路でまだよくわかっていない。暫定的な内因性の^PrP Scは、中間のPrP *または"サイレントプリオン"は、感染していない脳⁷で特定されていない。

生物物理学的および生化学的なアプローチの組み合わせを使用して、我々は感染していない哺乳動物の脳や神経細胞培養から不溶性のPrP ^Cの集計（指定IPRP ^C）が同定されセル^8,9。ここでは、洗剤液、スクロースステップ勾配沈降、サイズ排除クロマトグラフィー、具体的には、構造的に変更されたPrPのフォーム¹⁰とPK-治療にバインド遺伝子5タンパク質（g5p）によるIPRP濃縮度の超遠心分離を含め、これらの方法の詳細な手順を説明します。これらの方法の組み合わせで不溶性^の PrP ScとPrP ^Cの集合体でなく、通常の人間の脳からの可溶性PrP ^{Cのオリゴマー}だけを分離します。ここに記載されているプロトコルは、感染していない脳から感染した脳から^の PrP ScとIPRP ^Cの両方を分離するために使用されているので、それらは物理化学的特徴、神経毒性、そして二つのアイソフォーム間で感染性の違いを比較する機会を提供してくれる。そのような研究は大幅に感染性病原体のタンパク質性の我々の理解を向上させます。 IPRP ^Cの生理および病態生理学は、現時点では不明である。特に、新たに-idのentifiedヒトプリオン病はプロテアーゼ感受性prionopathy可変と呼ばれる、私たちはIPRP ^{C 11、12}と免疫反応挙動およびフラグメンテーションを共有する新しい^PrP Sc ^を発見した。また、我々は最近、IPRP ^Cがアルツハイマー病¹³のアミロイドβタンパク質と相互作用する主要な種であることを実証した。同じ研究では、これらのメソッドは、他の神経変性疾患に関与する非プリオンタンパク質の凝集体への応用を示唆し、アルツハイマー病¹³安部田集合体およびオリゴマーを分離するために使用されていました。

プロトコル

1。脳ホモジネートおよび（S2）界面活性剤可溶性と不溶性（P2）の画分の調製

1. 100mgの凍結ヒト脳組織を取り、100μlの溶解緩衝液（10mMトリス、150mMのNaCl、0.5％ノニデットP-40（NP-40）、0.5％のEDTA、pH7.4）を追加します。
2. コー​​ドレスモータにより駆動乳棒を用いて氷上でホモジナイズし、これはどちらか20で5分間ドライアイスでそれを凍結し、モータによって最初にして、手によって駆動乳棒を用いて再度ホモジナイズし、300μlまたは800μlの溶解バッファー（追加％または10％の全脳ホモジネート、それぞれ）。
3. 4℃で10分間、1,000×gで20パーセントまたは10パーセント合計脳ホモジネートを遠心℃の卓上遠心機を用いて上清（S1）を収集する。
4. 4℃で1時間、SW55ローターで35,000回転（100,000×g）で（ベックマン·コールター、フラートン、カリフォルニア州）で10％s1を超遠心きれいなチューブに界面活性剤可溶性画分を含む上清（S2）を転送します。洗剤不溶性含むペレットを再懸濁しまたは5倍濃縮製剤 - 100μlまたは10を作るために、200μlの溶解緩衝液中の画分（P2）。
5. PK - 消化のために、S2とP2分画の両方で1時間37℃で50μg/ mlでPKの同じ金額でサンプルをインキュベートする。 PK消化を終了するために5 mMおよびSDSサンプルバッファー（3％SDS、2mMのEDTA、4％β-メルカプトエタノール、10％グリセロール、50mMトリス、pH6.8）を等量の最終濃度でフッ化フェニルメチルスルホニルを追加します。 10分間サンプルを沸騰させ、5分間室温でそれらを冷却。彼らは、ウェスタンブロッティングのために準備が整いました。

2。ショ糖段階勾配で速度沈降

1. 氷上で30分間H ₂ O中の2％サルコシルの等量で450μlの20％S1をインキュベートする。
2. 0.5ミリリットルの60％それぞれ、30％、25％、20％、15％、および最大5ミリリットルの容量を持つベックマンチューブに10％ショ糖を追加します。
3. 10〜60％ショ糖段階勾配の一番上にS1の0.4ミリリットルをロードします。
4. 4℃で遠心する4℃で1時間、8,000 rpmで（200,000×gで、SW55ローター）、℃
5. 管の上部から各283μlを分画を収集し、合計で12画分を得る。
6. 、新しいエッペンドルフチュー​​ブに各画分20μlを取る20μlのサンプルバッファーを加え、10分間煮る。
7. フードで4分間クールのサンプルは、1分間、ボルテックスして、1,000×gで遠心分離します。プレキャストゲルにサンプルをロードします。

3。サイズ排除クロマトグラフィー

1. プリオン分子のオリゴマー状態を決定するために、1×30cmカラムでのSuperdex 200 HRビーズ（ファルマシア、ウプサラ、スウェーデン）を使用します。
2. デキストランブルー（2,000 kDa）は、サイログロブリン（669 kDa）は、アポフェリチン（443 kDa）は、（200 kDa）は、β-アミラーゼ、アルコール脱水素酵素（150 kDa）は、アルブミン（含む7分子量マーカー（シグマ、セントルイス、ミシガン州） 66 kDa）は、および炭酸脱水酵素（29 kDa）を200μlのサンプル量でシグマが推奨する濃度で独立してロードされます。
3. 青DEXTの溶出容積RANは、製品の指示により提供さ空隙容積（V ₀ = 8.45ミリリットル）、総容積（V _T = 24ミリリットル）を決定するために使用されます。ピーク溶出体積（V _e）はクロマトグラムと小数保持率から計算されます。 - /（V _T - V _{0）K AV} =（V ₀ V _{E）：K AV、}分配係数は、（サンプルの動作を定義します）の式を用いて計算されます。検量線は基準⁸のログMWに対してタンパク質スタンダードのK _AVをプロット_することにより決定されます。
4. 異なるFPLC画分に回収各種のPrP種の分子量（MW）は様々な規格のゲルろ過で生成された検量線に基づいて評価されます。
5. 各ランの列に1％サルコシルを含む溶解緩衝液中の200μlのS1を注入します。
6. クロマトグラフィーは、0.25ミリリットル/分であり、画分の流速でFPLCシステム（GEヘルスケア）で行われるsは0.25ミリリットルの各々は、フラクションコレクターを（アマシャムバイオサイエンス、RediFrac）を使用して収集されます。
7. 2時間-20℃で0.5ミリリットル予冷メタノールで0.125ミリリットル、各画分をインキュベートする。
8. 4℃で30分間、C卓上遠心機で13,000 xgでサンプルを遠心分離します。上清を捨て、前述したように、20μlのSDSサンプルバッファーでペレットを再懸濁し、室温まで冷却し、10分間、煮沸、プレキャストゲルにロードします。

4。 g5pによるPrPのキャプチャ

1. g5p分子（100μgの（）は親切にポーツマス、イギリスの大学から博士ジェフ·ニールとジョンMcGeehanによって提供される）7にコンジュゲートしている×10 ⁸トシル1ml中に100μgのg5pと350μlのg5pビーズをインキュベートすることにより、磁気ビーズを活性化20時間37℃のリン酸緩衝食塩水（PBS）。外部の磁力によりエッペンドルフチュー​​ブの側壁にg5pビーズを誘致して、すべてのソリューションを削除します。 PBSを含む1mlのビーズを洗浄3回アルブミン（BSA）を0.1％ウシ血清。
2. 非特異的結合をブロックするために5時間0.2Mのトリス-HCl、37℃、0.1％BSAを含有するpHが7.4℃で1mlにg5p結合ビーズをインキュベートしてから、1mlのPBSは、0.1％BSAを含有するビーズを洗浄三回は、上述したように。溶液を除去し、ビーズに1mlのPBSを加える。準備g5pビーズは4℃で少なくとも3ヶ月間安定している
3. g5pによるPrPのキャプチャを結合緩衝液1ml中の60μlのg5p結合ビーズ（10μgのタンパク質/ 6×10 ^7個のビーズ）（3％のTween-20、3％のNP-で100μlS1、分数またはP2をインキュベートすることによって行われますPBS、pH7.5）中で40。
4. 室温で3時間一定の回転とのインキュベーション後、PrPの含有g5pビーズは、溶液中のすべての非結合分子を簡単に削除できるように、外部の磁力によってエッペンドルフチュー​​ブの側壁に魅了されています。
5. 洗浄緩衝液で3回洗浄（2％Tween-20およびPBS中2％のNP-40、pHを7に続いて0.5）、g5pビーズは95で収集され、加熱され、SDSサンプル緩衝液中で5分間（3％SDS、2mMのEDTA、10％グリセロール、50mMのトリス-HCl、pH 6.8）℃で。
6. 室温で5分間、サンプルを冷却した後、試料を室温で5分間、1,000×gで遠心分離する。上清は、ウェスタンブロッティングの準備ができている。

5。ウエスタンブロット法

1. 負荷サンプルは約80分間、150Vで15％のTris-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad）を上にSDSサンプル緩衝液中で煮沸した。
2. ゲル上のタンパク質は70Vで2時間PVDFに転送されます。
3. で5％ミルクで膜をブロッキングした後、トリス緩衝生理食塩水0.01％のTween-20（TBS-T）は、膜は1E4（1、一次モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体3F4（1:40,000）で室温で2時間インキュベートする：1,000）、抗N ^{8（1:6,000）、}または抗CのPrP分子をプロービングのための^{8（1:6,000）。}
4. HRP結合ヒツジ抗マウスIgGでとのインキュベーション後1:3000、またはロバ抗ウサギIgGは1:3,000でのPrPバンドは、製造業者のプロトコルに従って、ECL Plusを使用して、コダックフィルム上に可視化される。

6。代表的な結果

のPrP ^Cの大部分はS2画分（ 図1）で回収されたものの、散発性CJDサンプルと比較して、IPRP ^C少量の正常脳におけるP2画分に検出された。フルレングスとN末端 ​​切断種を含む合計PrPの約5から25パーセントのために以前に^8、IPRPアカウント示されているように。

スクロースステップ勾配沈降を用いた解析では、非CJDの脳からのPrP ^Cのほとんどは1月3日トップ画分に回収されたが、PrPの少量のも通常は大きな凝集^8（ 図を含むボトム留分9月11日に検出されたことを明らかにした2）。

^PrP Scの種^の多様性が鳴ったモノマーからINGは、より大きな凝集体への小さなオリゴマーは、クロイツフェルト·ヤコブ病（ 図3A）と、脳内のゲルろ過によって単離した。しかし、分子量より大きい2000 kDaの大きな凝集体の少量はまた、正常の脳の不溶性画分（ 図3C）で検出された。さらには、PrP ^Cの二量体および四量体のみ不溶画分にも可溶性画分（ 図3Bおよび3C）で検出されなかった。

PKおよびPNGアーゼ処理後、g5pによってキャプチャPRPはPrP97-105 ⁸に対して1E4抗体を用いて検出した。 PrPの* ²⁰と呼ばれる三PK耐性コアフラグメントは、PrP * ^19、とPrP * ^7〜20 kDaで、〜19 kDaおよび〜7 kDaであった（ 図4、左パネル）に移行する場合、検出された。 1E4抗体は、配列identを持つ合成ペプチドとプレインキュベートしたときただし、プリオンは検出されなかった1E4によって検出されたバンドがPrP断片であることを示す1E4エピトープへのiCal（ 図4、中央のパネル）、。さらに、抗C抗体は約18 kDaの移行二つの異なるPrPの断片が明らかになった（PRP * ^18）とPrPに加え〜12から13 kDaの（PrP-CTF12/13）、* ^20（ 図4、右パネル）。

図1 IPRP ^CとIPRP ^Scの検出。 1時間37℃で総反応容量の1/10でPNGアーゼFで処理した後、タンパク質、全長またはN-末端（S2とP2）の可溶性および不溶性画分にPrPの種を切り捨て孤立から糖鎖を除去する正常コントロール（CTL）および散発性CJD（SCJD）から脳試料における超遠心分離によりPrP23-40（中央のパネル）に対してPrP106-112（左パネル）、抗Nに対して3F4で検出され、されたのPrPに対する抗C220から231（右パネル）。大量がS2に存在しているのに対し、CTLのサンプルでは、​​PrPの少量は、P2で検出された。これとは対照的に、多くのPRPはSCJDサンプルのS2よりもP2で検出された。

図2：蔗糖段階勾配におけるPrPの沈降。非CJDの脳試料S1の1〜11個々の画分におけるPrPはウェスタン3F4とブロッティングにより検出した。のPrP ^Cのほとんどは1月3日トップ画分に検出されたが、PrPの少量は、ボトム留分9月11日に観察された。また、上部と下部からPrPのバンドパターンが異なっている：底画分で回収したPrPが支配下のバンドを持っていながら、一番上の画分に回収PRPが支配的な上部のバンドを持っています。 PK処理^の PrP Sc ^をブロットの右側のコントロールとして読み込まれました。

図3可溶性および不溶性のPrP ^Cのオリゴマーの検出。正常なヒトの脳からの可溶性および不溶性のPrP ^Cは、それぞれ、超遠心分離により分離し、ゲルろ過を行った。個々の画分の分子の大きさは分子量マーカーのグループを実行することにより測定した。 SCJD脳試料から（A）の ^PrP Scの^種 。 PrPの種の2つの集団が検出されました：ゲルろ過画分49 - 27から33分画が大きな凝集体を含んでいるのに対し、65は、単量体および小さいオリゴマーが含まれています。正常対照の可溶性画分（S2）は（B）と不溶性画分（P2）（C）からのPrP ^Cの種^が検出された。 PRPは3F4抗体でプローブした。 PrPの二量体（フラクション55）、テトラマー（フラクション51）はP2でなく、正常な脳samplのS2だけでなく検出されたES（BとC）。大きな凝集のみ正常サンプルのP2（C）が検出された。

図4通常の人間の脳からg5p富む製剤中の様々なPK耐性IPRP断片の検出。 g5pによって豊かにサンプル（左パネル）1E4プロービングブロッティング前西にPKおよびPNGアーゼFで処理し、1E4は1E4エピトープ（中央パネル）、および抗Cと同一の配列を持っていた合成ペプチドとプレインキュベート（右パネル）。 1E4は、PrP * ²⁰は、PrP * ^19、とPrP * ^7（左パネル）と呼ばれる3 PK耐性PrPの断片を検出しました。ペプチドで1E4のブロッキングした後、何のPrP ^resは 1E4で検出されたバンドがPrP断片であることを示す、（中央のパネル）は検出されなかった。抗Cは、PrP * ¹⁸および/ ​​PRP-CTF12と呼ばれる2さらにPK耐性PrPの断片が明らかになったPrPの* ²⁰に加えて13。

ディスカッション

ここで報告アプローチの組み合わせは、通常の人間の脳から一貫して不溶性のPrP ^Cの集合体と水溶性のPrP ^{Cのオリゴマー}を分離します。 1時間100,000×gで遠心分離は広く水溶性PrP ^Cが14から不溶性の^PrP Scの分離のために使用されてきた古典的な方法です。それが効率的ですが、注意事項の一つは、遠心分離後の上澄み液（S2）を引っ張る時の汚染を避けるためです。 IPRP ^Cのゲル更新のPrP ^Cのそれとは異なっているので、それはP2画分に検出されたPRPはS2の汚染に起因するとは考えにくい。ショ糖密度勾配沈降アッセイは、その密度、大きさや形状¹⁵に基づいて、様々な^PrP Scの種^を分離するために用いられてきた。私たちは、分数12は、多くの場合、この画分は責任を負わないことかもしれないいくつかの粒子が含まれていることに気づいた。分数10はしばしばgreatesを含むものである分数の間でのPrP凝集体の量は⁸トン

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
フッ化フェニルメチルスルホニル	シグマアルドリッチ	P7626	2 - プロパノールで72 mMの
プロテイナーゼK	シグマアルドリッチ	P2308	H 2 O中の2 mg / mlの
PNGアーゼF	ニューイングランドバイオラボ	MWGF200
超遠心のLE-80K、ローターSW55	ベックマン·コールター	部品番号365668、356860
たSuperdex 200 HRのビーズ	GEヘルスケア	17-1088-01
AKTA FPLCシステム	GEヘルスケア	18-1900-26
分子量マーカー	シグマアルドリッチ	MWGF200	多様な
ダイナビーズM-280磁気ビーズ	インビトロジェン	143から01
3F4抗体	Covance	SIG-39600
1E4抗体	セルサイエンス	M1840
レディゲル15パーセントのトリス-HClプレキャストゲル	バイオ·ラッド	345-0020