方法論記事

複雑なサンプル中の特定のタンパク質のグリコシル化の多重化ハイスループットプロファイリングのための化学的にブロックされた抗体マイクロアレイ

DOI：

10.3791/3791

⸱

2012年5月4日

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1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

この記事について

サマリー

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本研究では、特定のタンパク質のグリコシル化プロファイリングに使用することができるレクチン検出法による多重化、ハイスループット抗体マイクロアレイのための改良プロトコルを記述します。このプロトコルは、新しい信頼性の高い試薬を備えており、前の手順に比べて大幅に時間、コスト、およびラボ機器の要件を軽減します。

要約

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本研究では、特定のタンパク質の糖鎖プロファイリングを可能にする、糖鎖結合タンパク質検出を伴うマルチプレックス高スループット抗体マイクロアレイの有効なプロトコルについて記述します。タンパク質の糖鎖付加は、タンパク質に見られる最も一般的な翻訳後修飾であり、タンパク質の物理的、化学的、および生物学的特性の多様な修飾をもたらします。糖鎖付加機構は特に疾患の進行や悪性転換の影響を受けやすいため、異常な糖鎖付加はがんやその他の疾患の早期検出バイオマーカーとして認識されています。しかし、タンパク質の糖鎖付加を研究するための現在の手法は、通常、多くの一般的な研究室や臨床現場で使用するには複雑すぎたり費用が高すぎたりするため、より実用的なタンパク質糖鎖付加研究法が必要とされています。本研究で記述する新しいプロトコルは、化学的にブロックされた抗体マイクロアレイを用いた糖鎖結合タンパク質（GBP）検出を利用しており、タンパク質の糖鎖付加の研究に必要な時間、コスト、および実験設備要件を大幅に削減します。本手法では、複数の固定化糖タンパク質特異的抗体がマイクロアレイスライド上に直接プリントされ、抗体上のN-糖鎖がブロックされます。ブロックされ固定化された糖タンパク質特異的抗体は、マイクロアレイスライドに直接塗布された複合試料から糖タンパク質を捕捉し、単離することができます。その後、ビオチン化レクチンやその他のGBPをマイクロアレイスライドに塗布することで糖鎖検出が行われ、結合レベルはDylight 549-Streptavidinを用いて決定できます。抗体パネルの使用と複数のビオチン化レクチンによるプロービングを通じて、本手法により、特定のヒトまたは動物試料に含まれる異なるタンパク質の効果的な糖鎖プロファイルの構築が可能になります。

はじめに

タンパク質の糖鎖付加は、タンパク質において最も普遍的な翻訳後修飾であり、タンパク質の物理的、化学的、および生物学的特性を変化させ、さまざまな生物学的プロセスにおいて基本的な役割を果たしています1-6。糖鎖付加機構は特に疾患の進行や悪性転換の影響を受けやすいため、異常な糖鎖付加はがんやその他の疾患の早期検出バイオマーカーとして認識されています7-12。実際、肝細胞がんに対するα-1フェトプロテイン（AFP）のL3画分13-15や、膵臓がんに対するCA19916, 17など、現在のほとんどのがんバイオマーカーは、すべて糖タンパク質上の異常な糖鎖部分です。しかし、タンパク質の糖鎖付加を研究する方法は複雑であり、日常的な研究室や臨床現場には適していませんでした。Chen et al.は最近、複雑な試料中の天然糖タンパク質の高スループットかつマルチプレックスな糖鎖プロファイリングを実現するため、糖鎖結合タンパク質（GBP）検出法を用いた化学的ブロッキング抗体マイクロアレイを開発しました18。このアフィニティベースのマイクロアレイ法では、固定化された複数の糖タンパク質特異的抗体が、マイクロアレイスライド上で直接、複雑な混合物から糖タンパク質を捕捉・単離し、捕捉された個々のタンパク質上の糖鎖をGBPで測定します。すべての通常の抗体は、ほとんどのGBPによって認識され得るN-糖鎖を含んでいるため、この方法における重要なステップは、抗体上の糖鎖がGBPに結合しないよう化学的にブロッキングすることです。その手順では、まず遮光条件下で酢酸ナトリウム緩衝液中のNaIO4を用いて、抗体上の糖鎖のcis-ジオール基をアルデヒド基に酸化させました。次に、このアルデヒド基をクロスリンカーである4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH)のヒドラジド基に結合させ、続いてMPBHのマレイミド基にジペプチドのCys-Glyを結合させました。これにより、抗体糖鎖上のシス-ジオール基が嵩高い非水酸基に変換され、レクチンやその他のGBPが捕捉抗体に結合することが妨げられました。このブロッキング手順により、GBPやレクチンは捕捉されたタンパク質の糖鎖にのみ結合するようになります。この化学的ブロッキングの後、血清試料を抗体マイクロアレイとともにインキュベートし、続いて異なるビオチン化レクチンおよびGBPを用いて糖鎖を検出し、Cy3-ストレプトアビジンで可視化しました。抗体パネルと複数のレクチンプローブを並行して使用することで、与えられた試料中の複数のタンパク質の個別の糖鎖プロファイルが得られます18-20。この方法は、多くの異なる研究室で成功裏に導入されています1, 7, 13, 19-31。しかし、MPBHとCys-Glyの安定性、および本法における複雑で長時間を要する手順が、再現性、有効性、および効率性に影響を及ぼしていました。本新しいプロトコルでは、MPBHとCys-Glyの両方を、より安定な試薬であるグルタミン酸ヒドラジド（Glu-hydrazide）に置き換えました。これにより、手法の再現性が大幅に向上し、全手順が簡略化および短縮され、1営業日以内に完了することが可能となりました。本新しいプロトコルでは、一般的な研究室で日常的なタンパク質糖鎖付加研究に容易に導入でき、再現性と反復性のある結果を得るために必要な詳細な手順と技術について説明します。

プロトコル

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1。アッセイ用の抗体マイクロアレイを印刷する

  1. リン酸緩衝生理食塩液、pH7.2（PBS）で0.5 mg / mlにすべての抗体を希釈する。
  2. 384ウェルソースプレートに各抗体のアリコートを40μl。
  3. Scienion sciFLEXARRAYERのマイクロアレイ上に384ウェルソースプレートをロードします。
  4. ターゲットとしてマイクロアレイ上20 PATHマイクロアレイスライドをロードします。
  5. 27抗体および制御タンパク質が9x9のパターン（ 図1E、1F）に三重で発見された48同一のサブアレイを印刷し、マイクロアレイを設定します。
  6. 抗体マイクロアレイスライドを印刷するためにマイクロアレイを開始します。
  7. 抗体マイクロアレイスライドを収集し、乾燥したスライドカセットに保存します。真空シーラー（Foodsaver）を使用して、ビニール袋にカセットを密封し、真空。
  8. 4℃の冷蔵庫に密封されたマイクロアレイスライドを格納します。

2。化学的にGBPを防止するための抗体マイクロアレイをブロック捕捉抗体に結合する

マイクロアレイアッセイ、マイクロアレイスライドを化学的にブロックされて一度起動して、約8時間持続します。一度マイクロアレイアッセイを開始する（ステップ2から8まで）を完了する必要があります。

  1. マイクロアレイは、冷蔵庫の外にスライドして取り、30分間室温に平衡化させます。
  2. 0.1％ツイーン（CBT0で15 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0で、ストレージボックスからスライドを削除すると簡単に洗面器を洗浄し、スライドに一回0.1％ツイーン20（PBST0.1）とリン酸緩衝生理食塩水pHは7.2で、それらを洗い流して、シーケンシャル方式で0.1）。スライド洗濯盆地で10分間CBT0.1でスライドをインキュベートします。
  3. 15mMの酢酸ナトリウム緩衝液5.0（CB）で、新鮮な150mMの過ヨウ素4を準備し、使用する前に光を避けながら、冷蔵庫の中に洗面器を洗浄し、スライドにに保管してください。
  4. CBからスライドを削除し、抗体側に新鮮な過ヨウ素4を含む流域に入れて上向き。光を避け、穏やかな冷蔵庫で4℃で振とうしながら2時間スライド流域をインキュベートするためにアルミ箔と流域をカバーしています。
  5. CB中の10mMヒドラジドグルタミン酸（ブロッカー）300 mLを準備します。
  6. 流域からスライドを削除して、簡単にスライド洗濯盆地で各5分間の時間CBを3回で洗ってください。
  7. 穏やかに撹拌しながら室温で2時間洗浄流域のブロッカーでスライドをインキュベートします。
  8. 流域からスライドを削除し、3分間PBST0.1でそれらを洗ってください。

3。ウシ血清アルブミンとマイクロアレイへの非特定のバインディングをブロック（BSA）

  1. スライド洗濯盆地では0.5％ツイーン（PBST0.5）とリン酸緩衝生理食塩水pH7.2の1％のBSAの300ミリリットルを準備し、穏やかに振とうしながら室温で1時間流域のマイクロアレイスライドをインキュベートします。
  2. 3分ごとに時間PBST0.1で3回スライドを洗浄します。
  3. スライドを置くスライドラック、およびマイクロアレイスライドを乾燥させる2分間遠心分離上の1200×gでスピン。

4。各サブアレーを分離するためのマイクロアレイスライド上にプリントワックスグリッド

  1. 70℃でワックスインプリンタを予熱5分のC。
  2. ワックスに直面している抗体側とワックスインプリンタにブロックされたマイクロアレイスライドをロードします。穏やかに均等にスライド上にプリントワックスへのハンドルを引き出します。

5。マイクロアレイスライド上に血清サンプルを適用します。

  1. ステップ2.4​​の間に、1つのサンプルの糖鎖プロファイリングアッセイ（5.1.1）、または複数のサンプルの間で、単一の糖epiptope測定（5.1.2）のいずれかの血清サンプルを準備します。
    1. 複数のGbpsを使用して1つの血清サンプル中の複数の血清糖タンパク質の糖鎖測線の実験（サンプル実験1を参照）では、1の血清サンプルは、すべてのサブ配列に適用されます。このケースでは、40μlの血清十分な、0.1％を含むPBS 360μLに希釈されTween-20を、0.1％BRIJ 35、マウスIgG、ラットIgGを100μg/ mLで、ウサギIgGを100μg/ mLと100μg/ mLで、ヤギの100μg/ mLのロバIgGのIgGおよび100μg/ mlの。このボリュームは、それぞれのサブアレイに希釈した血清溶液6μlを適用するために十分である。
    2. 1 GBP検出（サンプル実験2を参照）を使用することで、複数の血清サンプル間で複数の血清蛋白質の1つの糖鎖測定の実験である。このケースでは、1μlの血清十分な、0.1％Tween-20で、0.1％BRIJ 35、マウスIgG、ラットIgG、ウサギIgGの100μg/ mLと100μg/ mLのは100μg/ mLを含有するPBS中、第9μLに希釈され、ヤギIgG、ロバIgG抗体の100μg/ mLと100μg/ mLで。このボリュームは、それぞれのサブアレイに希釈した血清溶液を6μLを適用するために十分である。
  2. ステップ4のワックスの押印後、慎重にスライドの各サブアレイに希釈したサンプルまたは対照サンプル6μL（PBST0.1）を適用します。室温で濡れたペーパータオルで加湿カセットでスライドをインキュベート1時間インキュベートした。
  3. 3分ごとに時間PBST0.1 3回スライドを洗浄します。
  4. 2分のために1,200 xgでそれを回転させてスライドを乾燥させます。

6。スライド上にビオチン化GBP（レクチンまたは抗糖鎖抗体）を適用

  1. ステップ2.4​​の間に、PBST0.1にビオチン化レクチン/ Gbpsの10μg/mlのを準備します。
    1. 複数のレクチンとそのプローブつのサンプル（サンプル実験1）糖鎖プロファイリング実験では、すべてのサブアレイのために十分であるビオチン化レクチンの350μLを準備します。
    2. 複数のレクチンを用いて複数のサンプル内の単一の糖鎖エピトープ/バイオマーカーのスクリーニングでは、一方の部分配列で十分です各ビオチン化レクチンの10μlを準備します。
  2. スライドの各サブアレイに希釈したビオチン化レクチン（s）の6μLを適用し、1時間室温で湿紙タオルで加湿スライドボックスでインキュベートします。
  3. 各TIは、3分間PBST0.1 3回スライドを洗浄します私を。
  4. 2分間遠心機で1,200 xgでそれを回転させてスライドを乾燥させます。

7。蛍光検出用色素標識ニュートラビジンを適用します。

  1. すべてのサブアレイには十分ですDylight 549標識されたニュートラの350μLを準備します。
  2. 各サブアレイにDylight 549標識されたニュートラの6μLを適用し、1時間室温で加湿スライドカセット内のスライドをインキュベートします。
  3. 3分ごとに時間PBST0.1 3回スライドを洗浄します。
  4. 2分間遠心1200×gでそれを回転させてスライドを乾燥させます。

8。スライドをスキャンすることによって、マイクロアレイスライドのイメージを取得する

  1. 10μmの分解能での蛍光マイクロアレイスキャナーを用いてスライドをスキャンします。レーザーとPMTの設定が可能な限り強力な​​はずですが、全くの飽和点が観察されていません。

9。データの抽出と分析

  1. ArrayPro 3.2で画像を開きます。
  2. 抗体スポットの位置を示しています。配列マップに従って配列のテンプレートを設定します。慎重に画像内の対応する場所に、各テンプレートの円の位置を合わせます。
  3. さらに分析するためのExcelファイルに各スポットの強度を抽出します。

10。代表的な結果

サンプルの実験1

複数のレクチンの検出と化学的にブロックされた抗体マイクロアレイを用いた肝細胞癌患者血清サンプル中の複数の血清糖タンパク質の糖鎖プロファイリング。

この実験の目的は、レクチンの検出と化学的にブロックされた抗体マイクロアレイを用いて肝細胞癌（HCC）患者の血清サンプル20糖タンパク質の個々の糖鎖プロファイルを探ることである。 Sで説明したように26抗体およびビオチン-BSAを含む48同一の部分配列を含む抗体マイクロアレイは、設計·製造​​されました1 TEP。これら26の抗体は、 表1に示すように、質量分析、タンパク質の同定12、32と組み合わせてレクチンベースの免疫沈降を用いてHCC患者の早期診断値を有望として識別20血清糖タンパク質に反対した。代表的な一サブアレイに三重に印刷された抗体のスポットパターンと配置は、それぞれ、 図1E及び1Fに示されています。他のいずれかが（ 図1B）、分析化学的にブロッキング手順の重要性を実証するために、同じ糖鎖プロファイリング実験を行うために使用されたされたときに2つの同一のマイクロアレイスライドを、1は、化学的に、（ 図1A）ブロックされませんでした。化学的にブロックされたスライド（ 図1B）では、実験では、ステップ2で開始し、どれも化学的にブロックされたスライド（ 図1A）は、実験では、ステップ3からスタートしました。実験はfollowinによって運ばれましたグラムステップ5.1.2と6.1.2を除き、プロトコルに記載されたすべての手順を実行します。ステップ5.2では、PBST0.1対照試料は、カラム1と3の部分配列に適用され、プールされたHCCの血清サンプルは（ 図1Gに示すように）列それぞれ2と4、のサブアレイに塗布した。この比較は、化学的に遮断した後に有効性、手続きの効率化だけでなく、抗体の抗原結合親和性を示すことです。グリコシル化のプロファイリングについては、 図1Gに示すように、別の糖鎖18、20に固有の各サブアレイに適用されたことを22ビオチン化レクチン（表1に示すように）。プロトコルに従うことにより、糖鎖プロファイリングアッセイの後に化学的にブロックされた（ 図1B）および非化学的にブロックされた（ 図1A）マイクロアレイの画像。のような非化学的にブロックされたマイクロアレイ（ 図1Aおよび図1C）、列1と3の部分配列で示されているのみPBST0.1は、抗体を取得するためにバインドされているほとんどのレクチンを適用し、血清試料が適用された、これらの列2のサブアレイおよび4に匹敵することが非常に高いバックグラウンドを示した。これはマイクロアレイスライドから糖鎖プロファイル情報を取得することは不可能です。逆に、同じ実験を化学的にブロックされた抗体マイクロアレイスライド上で行われたときに、1列目だけPBST0.1が適用された3の部分配列は、ほとんどのレクチンは、抗体を捕捉するには、noまたは非常に低いバインディングを示さなかった。一方、高い抗原バインディングはまだ血清試料（ 図1B及び1D）が適用された、2列目と4にサブアレイで観察された。これらの結果は、化学的にブロッキング手順は、抗体に捕捉された糖タンパク質の糖鎖の測定は前面の重要なステップであることを示した。プロトコルに従うことによって、肝細胞癌血清中の22糖タンパク質の糖鎖プロファイルを得ることができます。

実験2

変更されたfucos用画面差別肝硬変と肝細胞癌患者に対するバイオマーカーとして特定の血清糖タンパク質上にylation。

この実験の目標は、肝硬変と肝細胞癌（HCC）患者を識別するバイオマーカーとしての特異的血清糖タンパク質の変化したフコシル化のために画面になります。このアッセイで唯一の血清サンプルはすべてのサブアレイに塗布し、様々なレクチンをプローブとした実験1、、、HCCと肝硬変患者から合計40種類の血清サンプルとは異なる、それぞれのサブアレイ上に塗布し、1レクチン（AALでプローブした。）そのようなTテスト、受信者動作特性（ROC）曲線、などの統計分析は、ディストリビューションまたはすべての血清サンプル中の個々のタンパク質の糖鎖epiptope /バイオマーカーの診断性能を評価するために行われました。我々は、この研究では抗CA19-9と抗シアリルルイスX抗体を除いて実験1で製造された同じ抗体マイクロアレイを使用していました。 experimentは、5.1.1と6.1.1ステップ以外のステップ9に9月2日から実施されました。合計20肝硬変から40の血清サンプルと20のHCC患者は、陰性コントロールとしてPBSをサンプルと一緒に48サブアレイのランダムな部分配列で適用された。各捕捉されたタンパク質のフコシル化は、その後、ビオチン化フコース特異的レクチンを用いて検出した。 図1に示されているマイクロアレイの画像は、代わりにキャプチャされた抗体のマイクロアレイ（ 図2D）（図2E）でキャプチャされた血清タンパク質に結合したレクチンAALを示した。全てのスポットのAAL結合強度は、次に抽出し、HCCと肝硬変群との間差別の各血清タンパク質のフコシル化（AAL結合強度）の性能を評価するためにTテストとROC曲線を用いて分析した。結果は、GP73タンパク質のフコシル化= 0.03および pを持つ2つのグループ間で最高の差別を与えたことが明らかになったエリアで、ROC曲線の曲線は0.72に等しい。この実験では、この手順を示した複数のタンパク質内の複数のサンプルの糖鎖エピトープ/バイオマーカーのスクリーニングのための迅速、効率的な方法です。

ID 試薬の名前 略語 会社 カタログ＃
L1 ビオチン化コンカナバリン ConAをベクターラボラトリーズ BK-1000
L2 ビオチン化したニワトコニグラレクチン SNA ベクターラボラトリーズ B-1305
L3 ビオチン化したレンズマメレクチン LCA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L4 ビオチンヒマ凝集素I RCA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L5 ビオチン化したヒイロチャワンタケレクチン AAL ベクターラボラトリーズ B-1395
L6 ビオチン化エリスリナ属Cristagalliレクチン ECL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L7 ビオチン化Griffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンII GSL II ベクターラボラトリーズ BK-3000
L8 ビオチン化した小麦胚芽凝集素 WGA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L9 ビオチン化したインゲンマメのErythroagglutinin PHA-E ベクターラボラトリーズ BK-2000
L10 ビオチン化したインゲンマメのLeucoagglutinin PHA-L ベクターラボラトリーズ BK-2000
L11 バイオtinylatedピ​​ーナッツ凝集素 PNA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L12 ビオチン化エンドウレクチン PSA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L13 ビオチン化Dolichos Biflorus凝集 DBA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L14 ビオチン化したチョウセン朝顔のレクチン DSL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L15 ビオチン化槐ジャポニカ凝集 SJA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L16 ビオチン化ダイズ凝集素 SBA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L17 ビオチン化したジャガイモ（ジャガイモ）レクチン STL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L18 ビオチン化Griffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンI GSL I ベクターラボラトリーズ BK-2000
L19 ビオチン化したソラマメVillosaレクチン VVL ベクターラボラトリーズ BK-2000
L20 ビオチン標識トマトソバ（トマト）レクチン LEL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L21 ビオチン化Ulex Europaeus凝集素I UEA I ベクターラボラトリーズ BK-1000
L22 ビオチン化ジャカリンジャカリンベクターラボラトリーズ BK-3000
A1 ヤギF（ab '）2フラグメント抗ヒトIgM、Fc5μ抗体 IgM抗体ジャクソンイムノリサーチ 109-006-129
A2 ロバのF（ab '）2フラグメント抗ヒトIgG（H + L）抗体 AB1 ジャクソンイムノリサーチ 709-006-149
A3 マウス抗ヒトIgG F（ab '）2のモノクローナル抗体 AB3 ジャクソンイムノリサーチ 209-005-097
A4 ヤギ抗ヒトα2マクログロブリンポリクローナル抗体 A2M GeneTex GTX62924
A5 ウサギ抗ヒトα-1アンチトリプシンポリクローナル抗体 A1AT リーBiosiences CA1T-80A
A6 マウス抗ヒトα-1アンチトリプシンモノクローナル抗体 A1AT シグマアルドリッチ SAB4200198
A7 ウサギ抗ヒトα-1アンチトリプシンポリクローナル抗体 ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 ウサギ抗ヒトα-1-アンティークhymotrypsinポリクローナル抗体 ACT フィッシャー·サイエンティフィック RB9213R7
A9 マウス抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体トランスフェリン GeneTex GTX101035
A10 ウサギ抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体トランスフェリン GeneTex GTX77130
A11 ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Jポリクローナル抗体 ApoJ アブカム ab7610
A12 マウス抗ヒトGP73モノクローナル抗体 GP73 アボット 14H4-23
A13 マウス抗ヒトGP73モノクローナル抗体 GP73 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC SC-101275
A14 ウサギ抗ヒトα-1フェトプロテインポリクローナル抗体 AFP GenWay GWB-41C966
A15 マウス抗ヒトα-1フェトプロテインモノクローナル抗体 AFP フィッツジェラルド 10-A05A
A16 マウス抗ヒトヘモペキシンモノクローナル抗体ヘモペキシン Assaypro 60190から05011
A17 マウス抗ヒトグリピカン3（1G12）モノクローナル抗体 GPL3 サンタクルスバイオ SC-65443
A18 マウス抗ヒトキニノゲン（LMW）モノクローナル抗体キニノゲン Assaypro 20333から05011
A19 ウサギ抗ヒトMMP-21モノクローナル抗体 MMP21 Epitomic 1955から1
A20 マウス抗ヒトCEACAM-1モノクローナル抗体 CEACAM R＆Dシステムズ MAB1180
A21 ラット抗ヒトDPPIV/CD26モノクローナル抗体 DPPIV R＆Dシステムズ MAB22441
A22 マウス抗ヒトPIVKA IIモノクローナル抗体 PIVICA 結晶化学 8040
A23 マウス抗癌胎児性抗原 CEA 米国の生物学 C1300
A24 マウス抗CA125癌抗原 CA125 米国の生物学 C0050-01D
A25 マウス抗CA19-9がん抗原 CA19-9 米国の生物学 C0075-18
A26 マウス抗ルイスxモノクローナル抗体ルイスX カルビオケム 434631
バイオビオチン化BSA（ポジティブコントロール） バイオホームメイド N / A

このプロトコルで使用されているレクチンと抗体の表1のリスト。

試薬/ sの機器の名前 会社 カタログ番号
非接触マイクロアレイ BioDot株式会社 sciFLEXARRAYER
384マイクロプレートフィッシャー 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
極薄のニトロセルロースcoateマイクロアレイスライド Gentel パス
スライドインプリンタ（オプション） ゲルカンパニー WSP60-1
シェーカーフィッシャー 15-453-211
遠心分離エッペンドルフ 5804 000.013
盆地/スライド染色ディッシュwiを洗濯スライド番目のリムーバブルラックフィッシャー 08から812
スライドインキュベーションチャンバー/顕微鏡スライドボックスフィッシャー 03-448-5
BRIJ 35、水に30 w / v％の溶液をアクロスオーガニック AC32958-0025
Tween-20をフィッシャー P337-100
過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素4） シグマ 311448
L-グルタミン酸γ-ヒドラジドシグマ G-7257
酢酸ナトリウム、無水（CH 3 COONa） シグマ S2889
ウシ血清アルブミン（BSA） Lampire生物学研究所 7500804
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（10X） デンヴィル科学 CP4390-48
Dylight 549コンジュゲートニュートラサーモ 22837
プロテアーゼインヒビターカクテル錠ロシュ社 4693159001
ChromPureヒトIgG、Fcフラグメントジャクソンイムノ 009-000-008
ChromPureヒトIgG、分子全体ジャクソンイムノ 009-000-003
ChromPureマウスIgG、分子全体ジャクソンイムノ 015-000-003
ChromPureマウスIgG、Fcフラグメントジャクソンイムノ 015-000-008
ChromPureウサギIgG、分子全体ジャクソンイムノ 011-000-003
ChromPureロバIgG抗体、分子全体ジャクソンイムノ 017-000-003
マイクロアレイスキャナテカン LSリローデッド

表2。リストこのプロトコルで使用する器具や試薬の。

figure-protocol-1
スキームレクチン抗体マイクロアレイベースの糖鎖バイオマーカー探索のプロセスを示す1スキーム1（ステップ2から4）：ブロッカー（GLU-ヒドラジド）とBSAと抗体マイクロアレイをブロックする。2（ステップ5）：血清サンプルを適用して、キャプチャ特異的な抗体を持つ特定の糖タンパク質で、3（ステップ6）：;：プローブマイクロアレイイメージングのためのDylight 549標識されたニュートラビジンとビオチン化AAL 4（ステップ7）、ビオチン化レクチン（s）を適用します。

figure-protocol-2
chemicによるHCC患者の血清サンプル中の複数の血清糖タンパク質のサンプル実験1グリコシル化プロファイリングの図1マイクロアレイ画像同盟国は、複数のレクチンの検出と抗体マイクロアレイをブロックされています。二つの同一マイクロアレイスライドは、（A）はいずれも化学的にブロックされない、または（B）化学的にブロックされたように、ステップ2で説明したように、両方のすべての糖鎖プロファイリングのための2から9までの手順と同様に、比較の目的を通り抜けた。 （A）と（B）マイクロアレイの画像は10ミクロンの分解能でステップ8でスキャンされます。 （C）なし、化学的にブロックされたマイクロアレイスライド（）の最初の2行の画像のズーム、非化学的にブロックされたマイクロアレイスライド（B）の最初の2行のイメージで（D）ズーム）、（E）各サブアレイ内抗体配列の図、（F）配列マップ：サブ配列内の各抗体の位置、各抗体名は、3スポットを表します。（G）の血清サンプルおよびレクチン場所：各血清サンプルを部分配列図に示すとレクチンは、塗布した。

figure-protocol-3
図2。マイクロアレイ画像肝硬変とHCC患者を識別することがバイオマーカーとしての特異的血清糖タンパク質の変化したフコシル化のためのサンプル実験2画面が表示されます。サンプル実験2セクションで説明したようにマイクロアレイアッセイを行った。 （A）ステップ8からマイクロアレイスライドのスライド全体のイメージは、各サブアレイ内抗体配列の（B）図（C）配列マップ：サブ配列内の各抗体の位置、各抗体名は、3スポットを表します。 （D）血清試料とインキュベートした部分配列のズームの画像、PBS対照とインキュベートした部分配列の（E）ズームの画像。

figure-protocol-4
図3試料実験1からの糖鎖プロファイリングの結果。各棒グラフは、20テストされたタンパク質の1つのレクチン結合プロファイル（または糖鎖プロファイル）を表します。合計22種類のレクチンは目を分析するために使用されたそれぞれのタンパク質の電子グリカンのプロファイル。

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ディスカッション

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1。標的タンパク質と捕捉抗体の選択

抗体マイクロアレイアッセイに先立って、いくつかの試薬及び材料を考慮するために必要と用意されています。糖鎖プロファイリングや糖鎖バイオマーカーのスクリーニングのための抗体マイクロアレイを設計するには、糖タンパク質の候補に特異的な抗体のパネルは、文献に従って、または、以前の結果から応じて決定されるべきである。これらの抗体は、通常、R＆Dシステム等のIgGなど、さまざまなベンダーから購入した私たちの前のテストでは、いくつかのIgMおよびIgEが完全に化学修飾した後にそれらの抗原結合親和性を失う可能性があることを示したので、捕捉抗体を好まれます。

2。抗体マイクロアレイの設計と製造

抗体マイクロアレイの製造は、専門的かつ高価なマイクロアレイ、および操作のためのよく訓練された人材を必要とするオプションの手順です。ただし、カスタマイズされた抗体マイクロアレイ製造トゥーレが容易に堅牢な結果のためのそのようなセロムBiosciences社などのサービスプロバイダか...

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開示事項

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謝辞

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ID 試薬の名前 略語 会社 カタログ＃
L1 ビオチン化コンカナバリン ConAをベクターラボラトリーズ BK-1000
L2 ビオチン化したニワトコニグラレクチン SNA ベクターラボラトリーズ B-1305
L3 ビオチン化したレンズマメレクチン LCA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L4 ビオチンヒマ凝集素I RCA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L5 ビオチン化したヒイロチャワンタケレクチン AAL ベクターラボラトリーズ B-1395
L6 ビオチン化エリスリナ属Cristagalliレクチン ECL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L7 ビオチン化Griffonia（Bandeiraea）SimplicifoliaレクチンII GSL II ベクターラボラトリーズ BK-3000
L8 ビオチン化した小麦胚芽凝集素 WGA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L9 ビオチン化したインゲンマメのErythroagglutinin PHA-E ベクターラボラトリーズ BK-2000
L10 ビオチン化したインゲンマメのLeucoagglutinin PHA-L ベクターラボラトリーズ BK-2000
L11 ビオチン化ピーナッツ凝集素 PNA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L12 ビオチン化エンドウレクチン PSA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L13 ビオチン化Dolichos Biflorus凝集 DBA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L14 ビオチン化したチョウセン朝顔のレクチン DSL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L15 ビオチン化槐ジャポニカ凝集 SJA ベクターラボラトリーズ BK-2000
L16 ビオチン化ダイズ凝集素 SBA ベクターラボラトリーズ BK-1000
L17 ビオチン化したジャガイモ（ジャガイモ）レクチン STL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L18 ビオチン化Griffonia（バンドeiraea）SimplicifoliaレクチンI GSL I ベクターラボラトリーズ BK-2000
L19 ビオチン化したソラマメVillosaレクチン VVL ベクターラボラトリーズ BK-2000
L20 ビオチン標識トマトソバ（トマト）レクチン LEL ベクターラボラトリーズ BK-3000
L21 ビオチン化Ulex Europaeus凝集素I UEA I ベクターラボラトリーズ BK-1000
L22 ビオチン化ジャカリンジャカリンベクターラボラトリーズ BK-3000
A1 ヤギF（ab '）2フラグメント抗ヒトIgM、Fc5μ抗体 IgM抗体ジャクソンイムノリサーチ 109-006-129
A2 ロバのF（ab '）2フラグメント抗ヒトIgG（H + L）tibody AB1 ジャクソンイムノリサーチ 709-006-149
A3 マウス抗ヒトIgG F（ab '）2のモノクローナル抗体 AB3 ジャクソンイムノリサーチ 209-005-097
A4 ヤギ抗ヒトα2マクログロブリンポリクローナル抗体 A2M GeneTex GTX62924
A5 ウサギ抗ヒトα-1アンチトリプシンポリクローナル抗体 A1AT リーBiosiences CA1T-80A
A6 マウス抗ヒトα-1アンチトリプシンモノクローナル抗体 A1AT シグマアルドリッチ SAB4200198
A7 ウサギ抗ヒトα-1アンチトリプシンポリクローナル抗体 ACT NeoMarkers RB-367-A1
A8 ウサギ抗ヒトα-1-アンチキモトリプシンポリクローナル抗体 ACT フィッシャー·サイエンティフィック RB9213R7
A9 マウス抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体トランスフェリン GeneTex GTX101035
A10 ウサギ抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体トランスフェリン GeneTex GTX77130
A11 ヤギ抗ヒトアポリポタンパク質Jポリクローナル抗体 ApoJ アブカム ab7610
A12 マウス抗ヒトGP73モノクローナル抗体 GP73 アボット 14H4-23
A13 マウス抗ヒトGP73モノクローナル抗体 GP73 SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC SC-101275
A14 ウサギ抗ヒトα-1 fetoproteinポリクローナル抗体 AFP 建屋 GWB-41C966
A15 マウス抗ヒトα-1フェトプロテインモノクローナル抗体 AFP フィッツジェラルド 10-A05A
A16 マウス抗ヒトヘモペキシンモノクローナル抗体ヘモペキシン Assaypro 60190から05011
A17 マウス抗ヒトグリピカン3（1G12）モノクローナル抗体 GPL3 サンタクルスバイオ SC-65443
A18 マウス抗ヒトキニノゲン（LMW）モノクローナル抗体キニノゲン Assaypro 20333から05011
A19 ウサギ抗ヒトMMP-21モノクローナル抗体 MMP21 Epitomic 1955から1
A20 マウス抗ヒトCEACAM-1モノクローナル不格好なやつY CEACAM R＆Dシステムズ MAB1180
A21 ラット抗ヒトDPPIV/CD26モノクローナル抗体 DPPIV R＆Dシステムズ MAB22441
A22 マウス抗ヒトPIVKA IIモノクローナル抗体 PIVICA 結晶化学 8040
A23 マウス抗癌胎児性抗原 CEA 米国の生物学 C1300
A24 マウス抗CA125癌抗原 CA125 米国の生物学 C0050-01D
A25 マウス抗CA19-9がん抗原 CA19-9 米国の生物学 C0075-18
A26 マウス抗ルイスxモノクローナル抗体ルイスX カルビオケム 434631
バイオビオチン化BSA（ポジティブコントロール） バイオホームメイド N / A

このプロトコルで使用されているレクチンと抗体の表1のリスト。

試薬/ sの機器の名前 会社 カタログ番号
非接触マイクロアレイ BioDot株式会社 sciFLEXARRAYER
384マイクロプレートフィッシャー 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
極薄のニトロセルロースcoateマイクロアレイスライド Gentel パス
スライドインプリンタ（オプション） ゲルカンパニー WSP60-1
シェーカーフィッシャー 15-453-211
遠心分離エッペンドルフ 5804 000.013
リムーバブルラックスライド洗面/スライド染色皿フィッシャー 08から812
スライドインキュベーションチャンバー/顕微鏡スライドボックスフィッシャー 03-448-5
BRIJ 35、水に30 w / v％の溶液をアクロスオーガニック AC32958-0025
Tween-20をフィッシャー P337-100
過ヨウ素酸ナトリウム（過ヨウ素4） シグマ 311448
L-グルタミン酸γ-ヒドラジドシグマ G-7257
酢酸ナトリウム、無水（CH 3 COONa） シグマ S2889
ウシ血清アルブミン（BSA） Lampire生物学研究所 7500804
リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（10X） デンヴィル科学 CP4390-48
Dylight 549コンジュゲートニュートラサーモ 22837
プロテアーゼインヒビターカクテル錠ロシュ社 4693159001
ChromPureヒトIgG、Fcフラグメントジャクソンイムノ 009-000-008
ChromPureヒトIgG、分子全体ジャクソンイムノ 009-000-003
ChromPureマウスIgG、分子全体ジャクソンイムノ 015-000-003
ChromPureマウスIgG、Fcフラグメントジャクソンイムノ 015-000-008
ChromPureウサギIgG、分子全体ジャクソンイムノ 011-000-003
ChromPureロバIgG抗体、分子全体ジャクソンイムノ 017-000-003
マイクロアレイスキャナテカン LSリローデッド

このプロトコルで使用する器具や試薬の表2のリスト。

参考文献

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