方法論記事

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

DOI：

10.3791/3798

⸱

2012年11月21日

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1Department of Neuroscience, University of Florida , 2Department of Psychiatry, University of Florida

この記事について

サマリー

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アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な "活動"の間の機構的な関係を明らかにする。

要約

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シナプス間隙、ドーパミンへのそのリリース後に、その前と後シナプスターゲット1を介して、その生物学的特性を発揮する。ドーパミン信号が拡散2-3、細胞外酵素4、膜輸送体5で終了します。ドーパミンニューロンの周囲のシナプス間隙に位置するドーパミントランスポーターは、内側ドーパミンフラックス（取り込み）を介して放出さアミンをクリアします。ドーパミントランスポーターはまたドーパミン5の外側への輸送または流出と呼ばれるプロセスで、内部から外部へのアミンを解放するために逆方向に働くことができます。 。フォワード（摂取）とリバース（流出）5：20年以上前スルザーらは、ドーパミントランスポーターは、次の2つのアクティビティのモードで動作することができます報告した。トランスポーターを介して流出を介して神経伝達物質放出は、細胞外空間にドーパミンを大量に移動させることができ、細胞外ドーパミンhで主要な調節的役割を果たすことが示されているomeostasis 6。ここでは、同時パッチクランプとアンペロメトリー記録は膜電位が制御されているミリ秒の時間分解能で流出機構を介してドーパミン放出を測定するために使用する方法について説明します。このため、全細胞電流と酸化（アンペロメトリー）信号はAxopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、全細胞電流記録、1,000 Hzのローパスベッセルフィルタが設定された）を使用して同時に測定される。アンペロメトリーは炭素繊維電極を記録するためには、第二増幅器（Axopatch 200B）に接続されており、細胞膜に隣接して配置され、700 mVに保持されます。全細胞と酸化（アンペロメトリー）電流を記録することができ、電流 - 電圧の関係は、電圧ステッププロトコルを使用して生成することができます。濃度への変換を必要とする通常のアンペロメトリックキャリブレーションとは異なり、現在は有効容積7を考慮せずに直接報告されています。従って、得られたデータいくつかの送信機はバルク溶液に失われるので、ドーパミン流出には下限を表しています。

プロトコル

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1。用品

  1. バックグラウンドノイズを低減する防振台（TMI）の上にファラデーケージをマウントします。
  2. 同時パッチクランプアンペロメトリー記録システムは、優れたDICの光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡を必要とします。車のバッテリーに灯台顕微鏡を接続します。システムのこのDC光源はさらに、電気ノイズを減少させるであろう。
  3. 油圧マイクロマニピュレーター（Siskiyou）さらに減少ノイズ。私達の構成では、我々は、全細胞記録のために右利きのマニピュレータを使用し、電流測定のために左利き。

2。記録用の電極を準備

  1. P-2000プラー（サター）に石英ピペットを用いてパッチ電極を引き出します。私たちのプルは、2つの熱サイクルで、約5秒続く。この熱時間は私たちの全細胞パッチピペットで一貫抵抗（MΩ3-4​​）をもたらしました。
  2. に電極を埋めるピペットは、2mMのドーパミンを含む溶液と右マニピュレーターにマウントします。アルミホイルでDAを含むピペット溶液を保持する容器を包む。氷上で保存する。ドーパミンは酸化可能である。光から保護し、氷の上で解決策を維持すると、ドーパミンの酸化速度が低下します。
  3. 優しく、収納ボックスからProCFE（ダガン）低ノイズカーボンファイバーアンペロメトリー電極を取り外します（ 図1に示すように）アンペロメトリアダプタに水銀、マウントと入力し、[右maniupulatorにマウントされます。炭素繊維の遠端を保持することによって損傷から炭素繊維の先端を保護します。先端を清潔にし、無傷であることを確認するために、ラボ顕微鏡で電極を点検してください。
  4. 外液を含有するガラスボトムシャーレに電極を入れて電流滴電極の整合性を調べます。ドーパミンの非存在下での現在のベースラインを記録します。皿に1mmのDA溶液10μlを追加します。良いアンペロメトリー電極REコー​​ド酸化電流の増加。アンペロメトリー電極が正常に動作して確実にし、各実験の開始時と終了時に、この手順を繰り返します。

3。グラスボトムペトリ皿内ド​​ーパミントランスポーターを発現するように遺伝子ドーパミン神経細胞や神経細胞の初代培養を始めて

  1. 優しく暖かい外液と細胞やドーパミンニューロン3回洗浄する。
  2. 顕微鏡ステージ上にグラスボトムシャーレをマウントします。

4。セルを視覚化し、実験を行う

  1. 明らかに細胞を可視化するための正しい焦点を見つける。パッチ電極に正の圧力をかける。その後、静かに溶液中に両方の電極をダウンさせると、セルに近接しています。
  2. セル（左側）、右側にパッチ電極の隣にアンペロメトリー電極を配置します。
  3. パッチ電極付きセルでgigaohmシールを達成。破裂に吸引シール細胞全体の構成を実現。
  4. 細胞内にドーパミンを含む内部液の透析のための5月8日分を許可します。
  5. 所望の電圧ステップまたはランプ·プロトコルを使用しています。同時にパッチピペットと膜電位はパッチピペットを介して制御されながら、ドーパミントランスポーターを介して全細胞電流とドーパミンの逆輸送を測定する電流測定型電極の両方からデータを取得します。

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結果

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アンペロメトリーとの複合パッチクランプは、電位依存DAT媒介DA流出。 図2Aは、細胞内環境と膜電位が全細胞パッチピペットによってクランプされるDATの媒介DA流出の代表的な実験設定や記録を示して測定することができます。アンペロメトリー電極が細胞膜（ 図2A）上に置かれている間、このテクニックを使用すると、YFP-DATのタンパク質を発現する細胞は全細胞パッチピペットを用いて電圧にクランプされます。全体のセル電極を2mM DAを含むピペット溶液で満たされている。原形質膜に触れるアンペロメトリー電極が700 mVに、DAの酸化還元電位よりも高い電位に保たれる。 DATの媒介電流（全細胞- 図2C及びアンペロメトリー- 図2D）-40 mVの保持電位（ 図2Bから-60〜+100 mVの膜電位に全細胞ピペットを踏んで記録されている強い>）。特定のDATを媒介DAの流出を決定するために、電流測定電流は、DATのアンタゴニストの不在と存在に記録することができます。 DAT...

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ディスカッション

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同時に電圧クランプとアンペロメトリーは、次の利点があります。すべての細胞型はアクセス可能であり、記録のために使用することができます。レコーディングが行われた細胞またはニューロンの同定は、シンプルで簡単です。特に、細胞が蛍光実験者が容易に目的の細胞や神経細胞を選択することができ、目的のタンパク質に蛍光タグを追加することで、ラベルが付いていた場合。実験的な構成では、パッチピペットを介して、または浴溶液10〜これらの薬剤を添加することによりどちらか薬理学的薬剤の均一かつ制御された送達を可能にする。同時パッチクランプアンペロメトリー技術は、ミリ秒の時間分解能で酸化され、トランスミッタのリリースによって異なるチャネルやトランスポーターの役割の調査を可能にしながら膜 電位が制御されます。同じ情報は、生化学的方法8を介して取得することはできません。このapproacのユニークな特徴の一つhは、それがパッチピペット7,11を介して、透析により細胞内環境の操作を可能にすることである。ただし、この手法は、電流滴電極が酸化性のみの送信機を検出できないという欠点...

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開示事項

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特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

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我々は、この原稿の重要なレビューのために博士Sanika Chirwaに感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DA026947、DA021471、そしてNS071122）によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
防振テーブルのw /ファラデーケージテクニカル·マニュファクチャリング株式会社 63から500シリーズ私たちはモデル63から543までを使用
倒立顕微鏡ニコンTE-2000 ニコン中止これで、EclipseのTi
二つの低雑音増幅器axopatch 200B 分子デバイス 800-635-5577
1-CV 203 BUのヘッドステージ分子デバイス 800-635-5578
1-HL-Uピペットホルダ分子デバイス 800-635-5579
Digidata 1440A / Dコンバータ分子デバイス 800-635-5580
2つのマニピュレータSiskyou、左と右利き Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
レーザーピペットプラーサターインスツルメンツ P-2000 888-883-0128
低ノイズの炭素繊維電極アンペロメトリー ProCFE www.dagan.com
低ノイズ石英ピペットサターインスツルメンツ QF100-70から7.5 888-883-0128
12ボルトのカーバッテリー広く利用可能
車のバッテリー充電器広く利用可能
試薬
塩化ナトリウム（NaCl） シグマ S7653
HEPES シグマ H3375
葡萄糖シグマ G7528
硫酸マグネシウム（MgSO 4） シグマ M2643
リン酸二水素カリウム（KH 2 PO 4） シグマ P5655
塩化カリウム（KCl） シグマ P9333
塩化カルシウム水和物（CaCl 2で •2H 2 0） シグマ 223506
塩化マグネシウム六水和物（MgCl 2を •6H 2 0） シグマ M2670
EGTA シグマ E0396

参考文献

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  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo. J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).
  3. Sulzer, D., Pothos, E. N. Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms. Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).
  4. Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission. J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).
  5. Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons. J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).
  6. Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).
  7. Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism. J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).
  8. Goodwin, J. S., et al. Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in. , 284-2978 (2009).
  9. Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).
  10. Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus. PLoS One. 5, e11382(2010).
  11. Gnegy, M. E., et al. Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter. Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).

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