コレステロール流出アッセイ

サマリー

コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。

要約

細胞のコレステロール含有量は、細胞膜の破壊、アポトーシスとネクローシス¹のセルの結果に多すぎる、または少なすぎるコレステロール、非常にタイトな限界内に維持する必要があります。細胞は細胞内合成から、血漿リポタンパク質からソースコレステロール、両方のソースは完全にコレステロールの細胞の要件を満たすのに十分であることができます。コレステロール合成と取り込みのプロセスが厳密に制御し、コレステロールの欠点は^、2稀であるされています。過剰なコレステロールは、より一般的な問題は³です。肝細胞の例外を除いて、ある程度副腎皮質細胞に、細胞はコレステロールを低下させることができません。細胞は、そのコレステロール含有量を削減するための2つのオプションがあります。も有毒であるコレステリルエステルで細胞をオーバーロードとしてコレステリルエステル、限られた容量を持つオプションにコレステロール値を変換し、コレステロール流出、潜在的に無限の容量を持つオプションに。コレステロール流出は仕様です。このようなATP結合カセットトランスポータータンパク質A1（ABCA1）とG1（ABCG1）とスカベンジャー受容体タイプのB1の細胞内輸送、数によって規制されてIFICプロセス。血漿中のコレステロールの自然な受容体は高密度リポタンパク質（HDL）およびアポリポタンパク質AIです。

コレステロール流出のアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出の割合を定量化するために設計されています。それはコレステロール流出および/または細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を維持するために、セルの容量を測定します。アッセイは、次の手順で構成されます。ステップ1：血清含有培地に標識コレステロールを添加し、24〜48時間のために細胞とインキュベートすることにより、細胞のコレステロールをラベリング。この手順は、コレステロールの細胞のローディングと組み合わせることができる。ステップ2：すべての細胞内コレステロールプール間で標識されたコレステロールを平衡化するための無血清培地中の細胞のインキュベーション。この段階は、細胞のchの活性化と組み合わせることができるolesterolトランスポーター。ステップ3：細胞外受容体や細胞から受容体への標識コレステロールの動きの定量と細胞のインキュベーション。コレステロールの前駆体は、新たに合成されたコレステロールを標識するために使用された場合、第四ステップは、コレステロールの精製は、必要な場合があります。

特定の治療（突然変異、ノックダウン、過剰発現または治療）が流出コレステロール、および（ii）プラズマアクセプターの容量がコレステロールを受け付ける方法に、セルの容量をどのように影響するか（I）：アッセイは、以下の情報を提供します病気や治療の影響を受けています。このメソッドは、しばしば心血管研究、代謝および神経変性疾患、感染症と生殖疾患のコンテキストで使用されます。

プロトコル

1。 ^[3 H] -コレステロールの調製

1. ドラフトでは、1.5ミリリットル遠心チューブ（0.5ウェル当たりμCiの（19放射能）が典型的なアッセイのために必要とされる）に^[3 H]コレステロールの必要量を分注する。
2. ^[3 H] -コレステロールをトルエン中に懸濁されている場合は、同様に1μCi（37放射能/μL。ボルテックスし、ミックスの最終濃度の100％エタノールのN2ガスを再懸濁して完全にそれを乾燥させてください。

2。メッキ細胞およびラベリング細胞コレステロール

ヒト単球^4,5、THP-1ヒト単球-マクロファージ^6,7,8、RAW 264.7マウスマクロファージ^{5,9,10,11、HeLa}細胞^12、内皮細胞、ヒト臍帯静脈：このプロトコルは、次のセルタイプを使用してテストされています血小板由来の細胞（HUVEC）、BHK-21細胞^9、ヒトとマウスの線維芽細胞^{13,14、HepG2}細胞、ヒト肝癌細胞¹⁵と、修正された形で、<> 16のsup。

1. 細胞を再懸濁し、それらをカウントします。 0.9ミリリットルの完全培地でウェルあたり0.2x10 ^6個の細胞の最終濃度で12ウェルプレートに細胞をプレート。細胞が成長し続け、流出実験の時間帯によって、ウェルあたり0.8×10 ^6個の細胞に到達します。そのような分化したTHP-1細胞として分裂しない細胞については、播種密度は、ウェルあたり0.8×10 ^6個の細胞である必要があります。それぞれ、24ウェルプレート、ダブルまたはウェルあたりの細胞数の半分 - 6を使用している場合。井戸の数は、各実験条件のために四重決定のための十分なはずです。
2. THP-1細胞の分化が必要な場合は、48〜72時間のためにメディアにPMA（最終濃度0.1μg/ ml）を追加します。
3. ^[3 H]コレステロールを含むマイクロチューブにメディアの小アリコートを追加します。
4. 完全なメディアの別のアリコート（100μl/ウェル）に^[3 H] ^のコレステロールを添加する前にメディアでチューブの側面を洗ってください。
5. 細胞（ウェルあたり最終容量が1 mlである）で各ウェルに^[3 H]コレステロールを含むメディアを追加します。細胞のない治療がラベリングの前に必要でない場合、細胞は^、[3 H]コレステロール含有培地に播種することができます。
6. 細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で48時間細胞をインキュベートします。

3。平衡インキュベーション

1. 48時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは健康であり、約80％コンフルエントであることを確認してください。
2. ^[3 H]コレステロールを含むメディアを削除します。 PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 3洗浄回数を繰り返します。
3. 無血清培地を準備します。血清フリー培地に、必要な場合には、LXRアゴニスト（例えば、1から4 mmol / lの時TO-901317など）やcAMPを（唯一のマウス由来の細胞を0.3モル/ l）を添加することにより細胞を活性化する。
4. 各ウェルに500μlの無血清培地を追加します。
5. （37℃、5％CO _2）細胞培養インキュベーター中で18時間インキュベートする。

4。コレステロール流出インキュベーション

1. 無血清培地で18時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは（最低80％のコンフルエンシー）健康とコンフルエントであることを確認します。
2. 無血清培地中のコレステロール流出受容体の溶液を調製します。受容体の例は次のとおりです。
   アポリポタンパク質AI（アポA-I）（最終濃度10μg/ ml）を
   高密度リポタンパク質（HDL）（最終濃度20μg/ ml）を
   シクロデキストリン（最終濃度200μg/ ml）を
   血漿（最終濃度1-2％）
3. PBSで穏やかに細胞を洗浄します。
4. 各ウェルにアクセプターと無血清培地250μlを添加します。
5. 背景の流出を（NOアクセプターと無血清培地への流出）を決定するために井戸のセットを1つ残す
6. 細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で2時間細胞をインキュベートします。必要に応じて流出インキュベーションの持続時間は30分〜8時間と異なる場合があります。

5。処理土mples

1. 2時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞を確認してください。
2. 1.5mlマイクロチューブにメディアを収集します。細胞の残骸を削除するには、室温で1から10分間14,000 rpmでスピン。
3. 7mlのシンチレーションバイアルに100μlのメディアを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で、残りのサンプルを保存
4. 30分のために冷凍庫にプレートを置きます。各ウェルに500μlのdH ₂ Oを追加します。すべての細胞がウェルの底から持ち上げていることを確認し顕微鏡下で細胞を確認してください。まだ付着した場合、4℃で一晩またはこすっ井戸でdH ₂ Oでプレートを残してどちらか。
5. すべてのセルがリフトオフした後、細胞塊を分割するために上下にピペッティングします。 7mlのシンチレーションバイアルに100μLを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で残りのプレートを保存
6. シンチレーションカウンターでシンチレーションバイアルを置きます。 ^[3 H]のカウントでカウンタの構成DPMユニット。

6。結果を分析する

1. コレステロール流出の速度は通常アクセプターへの細胞から移動したコレステロールの割合として表されます。次の式が使用されます。

2. 特定の流出は、受容体の存在下または非存在下（ブランク）の流出の差として計算されます。

7。タイムライン

8。代表的な結果

コレステロール流出実験の結果の例を図に示されています。 1。この実験では、THP-1ヒト単球があった別の受容体にマクロファージやコレステロール流出に分化したテストされています。ないアクセプター（ "空白"）と媒体へのコレステロール流出は0.79％であり、この値は、非特定の流出とみなされ、他の値から差し引いた。人間のアポA-I（終濃度30μg/ mlの）へのコレステロール流出は4.75％であった。リファレンス·血漿サンプルは、間実験の変動を監視するには、この実験に含まれていました。参照サンプルは、実験の多数間でのデータの正規化に使用されるが、我々はばらつきが大きい場合、検定を繰り返すことが賢明見つけることができます。患者は薬で治療した前と後の患者の血漿（最終濃度2％）がテストされています。それはこの患者の薬のコレステロール流出をサポートするために、プラズマの能力にマイナスの影響を与えたと結論された。

流出実験の結果の別の例を図に示されています。 2。この実験ではRAW 264.7マクロファージはLXRアゴニストTO-901317で一晩インキュベートした（最終濃度によって活性化または活性化されていない1μmol/ Lの）およびヒト血漿の同じサンプル（2％）へのコレステロール流出を試験した。これは、LXRアゴニストとABCトランスポーターの細胞内発現の活性化が細胞外受容体にコレステロールを解放するためにセルの容量を増加させると結論された。

図1。様々なアクセプターへのTHP-1細胞からのコレステロール流出。コレステロール流出の割合は、（すなわち、標識されたコレステロールの割合は、細胞から指定されたアクセプターに移動）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P <0.05。

図2。コレステロール流出のRAW 264.7ヒト血漿にLXRアゴニストにより活性化または有効になっていません。割合（すなわち、標識コレステロールの割合からのコレステロール流出は細胞からに移動指定されたアクセプター）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P <0.001。

ディスカッション

コレステロール流出を測定するために記載した方法は、細胞外コレステロール受容体への細胞からのコレステロールの動きを測定するために設計されています。この方法論を理解する上で、いくつかの重要な考慮事項があります。

ラベルと平衡

記載された方法論で標識されたコレステロールは血清含有血清に追加されます。詳細に調べなかったが、それはコレステロールは血清リポタンパク質に組み込まれ、それらが細胞に取り込まれることを想定しています。取り上げられるようにリポタンパク質およびコレステロールはリポタンパク質から細胞膜に移動するのに十分な時間を許可することが重要です。通常24時間標識は十分ですが、48時間のラベリングは、細胞内コレステロールの高い比活性を実現しています。それは^[14 C]コレステロールは^[3 H]コレステロール（二重標識実験などで）、特定の行為の代わりに使用されている場合ことを考慮する必要があります前者のivityは非常に低く、意図した特定の活動を達成するために十分な標識されたコレステロールを追加する...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬\セル	HeLa細胞	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
完全なメディア	RPMI - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌			M199 - 5％FCS - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞増殖サプリメント（ECGS）	DMEM - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌
無血清培地	RPMI - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌			M199 - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞の成長目のサプリメント（ECGS）	DMEM - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌
通過方法	1×トリプシン	サスペンション	落とす	1×トリプシン
通過率	午前3時10分	1時03分		1時20分	1時03分	1時03分
細胞活性化（オプション）		TO-901317 - LXRアゴニスト - ファイナルの濃4μM
その他の試薬		ホルボール12 -ミリステート13 -アセテート（PMA） - 細胞分化 - ファイナルの濃0.1μg/ml