単一セルの開発のプロファイリングと成熟網膜神経細胞

サマリー

単一網膜細胞およびそれらのcDNAのその後の増幅を単離するための方法が説明されています。単一細胞トランスクリプトーム組織内に存在する細胞の不均質性の程度を明らかにし、まれな細胞集団の新たなマーカー遺伝子を発見します。付随するプロトコルは、多くの異なる種類の細胞に合わせて調整することができます。

要約

細胞の高度に専門化が、非常に小さな集団が多くの組織で重要な役割を果たしている。非常にまれな細胞サブセットの細胞型特異的マーカーと遺伝子発現プログラムの識別は、標準的な全体の組織のアプローチを使用して挑戦されています。個々の細胞の遺伝子発現プロファイリングは、全組織^1-7のわずかな割合を構成する細胞の種類に前例のないアクセスを可能にします。さらに、この手法は、一時的に⁸の動的発達遷移中に細胞の小さな数字で表現される遺伝子発現のプログラムを調べるために使用することができます。

携帯電話の多様性のこの問題は、ニューロンの接続が非常に多様な細胞が⁹との間に発生する可能性があり、中枢神経系（CNS）で繰り返し発生します。異なる種類の細胞の正確な数は正確に知られていないですが、それは皮質私のように多くの1000などの異なるタイプが存在する可能性があることと推定されているtself ^10。複雑な神経回路の機能（s）はまれな神経細胞の種類とそれらが発現する遺伝子の一部に依存する場合があります。新しいマーカーを同定し、分子の異なるニューロンを分類するために助けることによって、単一セルのアプローチは、神経系の細胞型の解析に特に有用である。それはまた、神経前駆開発の初期段階で示差的に発現する遺伝子や遺伝子経路を識別することによって、神経発生のメカニズムを解明するのに役立つ可能性があります。

かなりの神経細胞の多様性を持つ単純な、簡単にアクセス組織として、脊椎動物の網膜は、細胞の開発、神経分化と神経多様化のプロセスを研究するための優れたモデルシステムです。しかし、中枢神経系の他の部分のように、この細胞の多様性は、特に桿体は、MAを作ることを考えると、特定の細胞の運命を採用する網膜前駆細胞を駆動する遺伝的経路を決定するための問題を提示することができ合計網膜細胞集団¹¹のjority。ここでは、単一網膜細胞（ 図1）で表される転写産物を同定するための方法を報告します。単一細胞のプロファイリング技術は、網膜^2,4,5,12の異なる細胞集団内の異質性の存在量の評価が可能になります。さらに、このメソッドは、細胞の運命は、網膜前駆細胞のサブセット⁸で発生するプロセスを意思決定の役割（複数可）を果たす可能性がある新たな候補遺伝子の宿主を明らかにした。プロトコルにはいくつかの簡単な調整で、このテクニックは、多くの異なる組織および細胞型に利用することができる。

プロトコル

1。細胞解離

1. 示されているプロトコルをまとめたフローチャートは、 図1である。このプロトコルを通して使用される特定の試薬 ​​のカタログ番号については、 表1を参照してください。 PBS浴中の網膜を分析。解剖中には、網膜が解離を阻害することができ、それらを維持するので、硝子体、レンズを取り外すことをお勧めします。網膜色素上皮（RPE）のすべてを削除するには、いくつかのインスタンスでは、それが完全にそれを削除することは不可能かもしれませんが常に非常に重要なことではありません。しかし、視細胞の単一細胞のプロファイリング実験のために、RPEを削除する必要があります。 RPEを削除に失敗すると、RPEに発現遺伝子を持つロッドセル·プロファイルの汚染につながる可能性があります。これは、おそらく感光体とRPEとの間の接続によるものです。
   解離については、全体の大人のマウスの網膜は、20を含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに10分間37℃でインキュベートするμlの活性化パパイン、5mMのEDTAの20μlの25mMのシステイン、および10mM HEPESを添加した360μlのハンクス平衡塩溶液（HBSS）。フィルター付きピペットチップは、潜在的な汚染を最小限に抑えるためのプロトコル全体のすべての手順を実行するために使用されます。パパイン濃度とインキュベーション時間は、年齢や組織の性質に応じて異なります。たとえば、生後0日（P0）で分離された網....

ディスカッション

研究の拡大を続ける数は、その遺伝子発現^6,8に関してより均一であると考えられていた集団での強固な細胞間の変動を明らかにしています。少なくとも一つのインスタンスで、この遺伝子発現の"ノイズ"が重要な生物学的機能^13を果たすことが示されている。個々の細胞間の遺伝子発現の違いは、伝統的な全体の組織の方法を使用して隠されている。これらの実験は、代表的な¹⁴ないかもしれない"平均的な"細胞の発現プロファイルを生成します。ここでは、単一網膜細胞からの遺伝子発現パターンの単離および同定するための手法を提案する。個々の細胞の研究は、研究者が種々の細胞型の特徴的な遺伝子発現パターンを決定するために重要である複雑な組織の根底にある細胞の不均質性を調べることができます。さらに、シングルセル分離は、枚ずつの活動を駆動する遺伝子プログラムの洞察を提供することができます開発全体の時点でidual細胞。複雑な細胞ネットワークの機能は珍しい種類の細胞のユニークな遺伝子発現に依存することができる神経系を研究する上で特に有用ですが、このプロトコルは、様々な組織から個々.......