マイクロ流体プラットフォームを使用した高スループットのタンパク質発現ジェネレータ

Summary

我々は、タンパク質配列の発現のためのマイクロ流体アプローチを提示する。デバイスは、マイクロメカニカルバルブで制御される反応室の数千から構成されています。マイクロ流体デバイスは、マイクロアレイプリント遺伝子ライブラリーに釣り合わせられる。これらの遺伝子は、その後、実験的な使用のための準備ができたタンパク質配列で、その結果、チップ上に転写され、翻訳されています。

Abstract

そのようなシステム生物学など急速に増加フィールドは、大規模なシステムの高スループット、および高忠実度の測定を可能にし、新技術の開発と実装が必要です。マイクロフルイディクスは、生化学生物物理学、およびセルベースアッセイ^1を包含^する 、このようなオンチップハイスループットスクリーニング実験を行うと、これらの要件の多くを満たすことを約束します。マイクロ流体デバイスの初期の頃から、このフィールドには、抜本的にマイクロ流体大規模集積回路^2,3の開発につながる、進化してきました。この技術は、切手サイズのフットプリント（ 図1）を持つ単一のデバイス上のマイクロメカニカルバルブの数千人の統合が可能になります。我々は、タンパク質配列のin vitro発現（ 図2）という名前のPING（タンパク質相互作用ネットワークジェネレータ） で生成するためのハイスループットマイクロ流体プラットフォームを開発しました。これらの配列には、多くの実験のためのテンプレートとして使用できますなどのタンパク質-タンパク質^4、タンパク質-RNA ⁵またはタンパク質-DNA相互作用^6。

デバイスは個別にマイクロアレイを使用してプログラムされた反応チャンバー、数千から構成されています。標準マイクロアレイスポッティング技術を使用してマイクロアレイを生成し、また潜在的な汚染や交差反応性を排除し、単一のスポットでマイクロ流体デバイスのプログラムにこれらの印刷されたマイクロアレイの各チャンバを調整することで、タンパク質^7、DNAの^8、小分子のアレイ化が可能になり、また、非常にモジュール化されさらにコロイド懸濁液。生物科学上のマイクロフルイディクスの潜在的な影響は非常に重要です。マイクロ流体ベースのアッセイの数は、すでに生物学的システムの構造と機能に新たな洞察を提供しており、マイクロ流体工学の分野は​​、生物学に影響を与えていきます。

Protocol

1。デバイス製造

1. スタンフォードマイクロフルイディクスファウンドリー（339 DTPA-D SU-8の制御カビやSPR220-7フロー金型購入www.stanford.edu /グループ/ファウンドリ ）。
2. ベーキング手順^9の後のエラストマー放出を促進するために10分間クロロトリメチルシラン（TMCS）蒸気にシリコーン型を公開します。
3. それぞれ二つの異なる比制御とフロー型では5:1と20:1のシリコーン系エラストマー及び硬化剤（ミックスウェル）の混合物を準備します。異なる比率は、複数の層の適切な接合のために必要である。
4. 制御層（約5ミリメートルの高さ）に5時01 PDMSを注ぐ。ドガ制御層と80℃で30分間焼く℃にその後、スピンコート（Laurell、米国）60秒2600 rpmで流動層の上に20時01 PDMSの混合物とは、30分間80℃でそれを焼く。スピンコーター速度は圧力でバルブ駆動に最適化されています15psiの。速い回転は低い活性化圧力とその逆の薄い層になります。我々が使用するデバイスは、基板からの剥離が発生する可能性がありその上に、フロー内のコントロールで25 psiと10 psiの制限があります。
5. 金型から制御層を分離する。それはゆっく​​りとではないにSU8パターンピー....

Discussion

本稿では、マイクロ流体プラットフォームを用いた高スループットの世代タンパク質アレイのための方法を提示します。配列の生成は、DNAテンプレートのマイクロアレイ印刷に、マイクロ流体デバイス内でDNAからin vitroでのタンパク質発現に基づいています。

我々の新規マイクロ流体プラットフォームは、プロテオミクスのための有望な、一般的なツールとなっています現在使用されている方法に比べていくつかの重要な利点を持っています。一つの利点は、膜結合タンパク質である。ミクロソーム膜¹¹の存在下で哺乳類の網状赤血球溶解物を用いたin vitroタンパク質合成では 、膜タンパク質を使用するために必要な条件"のような自然"を提供しています。さらに、マイクロフルイディクスは、非常に低いボリュームでタンパク質の発現を可能にし、タンパク質精製の必要はありません。これらは、従来の方法論の中で最も一般的なボトルネックです。実際には、タンパク質のさらなる最適化を in vitro CE.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/機器	会社	カタログ番号
PDMS-SYLGARD 184	ダウコーニングの米国	ESSEX-DC
クロロトリメチルシラン（TMCS	シグマアルドリッチ	C72854
エポキシ樹脂コーティングされたガラス基板	CELアソシエイツ米国	VEPO-25C
ポリエチレンオキシドglycole（PEG）	シグマアルドリッチ	81260
D-トレハロース二水和物	シグマアルドリッチ	T9531
ビオチン化-BSA	ピアース	PIR-29130
ニュートラ	ピアース	31050
ペンタのHis-ビオチン	キアゲン	34440
ヘペス	生物産業	03から025-1B
TNT-T7	プロメガ	L5540
c-MycのCy3の抗体	シグマアルドリッチ
コントロールボックス	スタンフォードマイクロフルイディクスファウンドリー
モールド	スタンフォードマイクロフルイディクスファウンドリー
ピン	ニューイングランドの小さな管株式会社
マイクロボアタイゴンチューブ	タイゴン	S-54-HL
マイクロアレイ	バイオロボティクス	マイクログリッド610
シリコーンピン	Synの並列論文	SMT-S75