吸引ピペット技術を用いた嗅覚受容ニューロンから記録匂い物質誘発性応答

サマリー

嗅覚受容ニューロン（ORNs）が受容体に最初のターンで嗅球の2次ニューロンに伝達される活動電位を引き起こすことを、現在の匂い信号を変換します。ここでは同時に匂い物質誘発性受容体マウスORNsから現在の活動電位を記録するための吸引ピペットのテクニックについて説明します。

要約

動物は鼻腔に位置化学感覚系を介してそれらの周りに臭気環境をサンプリングする。化学感覚シグナルには、食べ物の選択、捕食動物、同種と認識メイトや他の社会的に関連する手がかりとして複雑な動作に影響を与えます。嗅覚受容ニューロン（ORNs）が嗅上皮に埋め込まれた鼻腔の背の部分に位置しています。これらのバイポーラニューロンは嗅球（ 図1参照 、もともと一般生理学のジャーナルで発表Reisert＆趙^1）に軸索を送って、嗅覚をカバー粘液にどこ繊毛上皮から放射国境に単一の樹状突起を延ばす上皮。チャネル（ 図1） ^-繊毛は、最終的に毛様体伝達チャネル、環状ヌクレオチド依存性（CNG）をチャネルとCa ^{2 +}活性化Clを通る電流の流入を興奮につながるシグナル伝達機構が含まれています。その後depolarizationは、細胞体^2から4で活動電位の発生をトリガーします。

このビデオでは、ORNsから匂い物質誘発性の応答を記録するための "吸引ピペット技術"の使用方法について説明します。このメソッドは当初、桿体⁵から記録するために開発され、この方法の変形例は、マウスの錐体⁶から記録するように修正jove.comで見つけることができます。吸引ピペット技術は後でまたORNs ^7,8から録音するように適合された。簡単に言えば、嗅上皮と細胞単離の解離後、ORNの全体の細胞体は、記録ピペットの先端に吸引される。デンドライトと繊毛は浴溶液にさらされると、例えば匂い物質または薬理ブロッカーアプリケーションを有効にするソリューションの変更することがアクセス可能な状態のままです。この構成では、細胞内環境へのアクセスが得られません（無細胞全体の電圧クランプ）と細胞内の電圧が変化すること自由に残っています。これは、すべて繊毛と細胞体⁹によって発射速い活動電位を起点遅い受容体電流の同時記録をOWS。これらの2つの信号間の動態の違いは、それらが異なるフィルタ設定を使用して分離することができるようになります。この手法は、任意の野生型またはノックアウトマウスで使用することができますまたはもORNsの特定のサブセットを標識するためにGFPを発現ORNsから選択的に記録するために、例えば与えられた嗅覚受容体やイオンチャネルを発現している。

プロトコル

1。録画設定

記録室はエアテーブル上に取り付けられ、電気的にファラデーケージを使用してシールドされている位相差光学ニコンTE2000U Eclipseの倒立顕微鏡に搭載されている。プレキシガラスの記録室には2つのセクションが部分的障壁によって分離し、シラン化スライドガラス上に接着で構成されています。他の着臭剤にはまだ決着が使用されていない細胞の早期の曝露を最小限にするために記録中に刺激露光に使用されている間、チャンバの1つのセクションのセルを解決するために使用されます。録画設定をペレットピペットホルダ及び接地電極に取り付けられた吸引ピペット（下記参照）で構成されています。吸引ピペットはマイクロマニピュレーターを使用して配置されています。スティミュラス·ソリューションは、それぞれの正方形の管が0.7ミリメートル×0.7ミリメートルであることと、トリプルバレルガラス正方形の管を使用して適用されます。トリプルバレルガラスがマニピュレータに搭載された電動の高速ステップ灌流システム（SUTに接続されていたTER SF-77B、ワーナー·インスツルメンツ）や〜45°の角度で記録室に入った。トリプルバレルガラスの端はトリプルバレルガラスの最終面（開口部）がピペットの緊密な位置決めを可能にするために、垂直となるように再び45°の角度で面取りした。

標準哺乳類リンゲル液及び接地電極でいっぱい吸引ピペット電極電圧クランプモードでパッチクランプアンプの1GΩヘッドステージ（PC-501A、ワーナー·インスツルメンツ）に接続されている。アンプ（5kHzでローパスフィルタ）からのアナログ信号は、リアルタイムで信号を監視するためにデジタルオシロスコープに表示され、また信号がLow通過フィルタ処理されている8極ベッセルフィルタ（クルーン-ハイト）に接続されている50 Hzで。両方の信号は（5 kHzと50 Hzのローパスフィルタ）データ取得のためにPCに接続されているA / Dコンバータ（ケンブリッジ電子設計マイクロ1401 mkIIの）に供給される。データは、信号3 ACQを使用して記録されている10kHzのサンプリング周波数でuisitionソフトウェア（ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン）。信号は最初のレコードに2つの異なる帯域幅重畳活動電位とその後単独で現在の受容体と一緒に現在の受容体（ 図2参照 ）で記録されます。灌流システムはリンガー（コントロール）ソリューションと匂い物質刺激または所望の組成の任意の解決策の間で急速に切り替えるために使用して、PCおよびシグナル3ソフトウェアによって制御されます。ソリューションは60ミリリットルの注射器に含まれており、流量は医療グレードの静脈フローレギュレータによって制御されます。一般的に、流量は1ml /分に設定されています。

記録ピペットで吸引は、次の方法で制御されます。ピペットホルダーのサイドポートが順番に高さ調節可能なオイルタンクに接続されているオイルラインに接続されている。貯水池を上げるか、下げるとPの先端を介して、そのピペット圧力、したがってリンガーの流れを確実にipetteは最小限とわずかに正である。追加の吸引または圧力が記録ピペットの先端に孤立ORNの細胞体を吸うためにもう一方の端でマウスピースと貯水池の空域に接続されたチューブを介して適用することができます。

実験は密接に細胞の本来の生理的状態をシミュレートするために、37℃で行われる。温度は、溶液を含有するステンレス鋼管が^10を通過されるときに通過するセラミック抵抗から構成されてカスタムメイドの加熱ユニットによるソリューションを渡すことによって制御される。温度は熱電対温度計（フルーク）を使用して監視されています。

2。ソリューション

哺乳類リンゲル液（MM）：140のNaCl、5mMのKCl、1 MgCl _2を 、2のCaCl _2、0.01 EDTA、10mM HEPES、10mMグルコース。 pHはNaOHで7.5に調整した。 10パーセント希釈のリンゲル液は、接合電流を測定するために使用された。 OdoraNTソリューション：アセトフェノンとオイゲノールを20mM DMSOストックからリンゲル液で毎日調製した。

3。電極を作る

1. サッターのP-97マイクロピペットプラーの毛細血管unfilamentedホウケイ酸ガラスを置き、長いテーパーでマイクロピペットを引き抜きます。
2. 接眼レンズとステージ上に取り付け可動ダイヤモンドナイフでレチクルを装着し、順番にあるニコンE200のEclipseの顕微鏡に搭載されたカスタムメイドのマイクロピペットホルダーにピペットを転送します。
3. 20倍対物レンズ下にピペットの先端を観察し、レチクルをガイドとして使用して、穏やかにスクライブピペットは10μm幅（外径）である場合、カスタムメイドのダイヤモンドナイフを使用して90°の角度でピペット。
4. 先端に向かってさらにダイヤモンドナイフを動かして、徐々にダイヤモンドナイフで先端に圧力をかける。ピペットチップは、それがスクライブされた時点ではきれいに破ってはならない。

あるいは、3.1へのステップを3.4を組み合わせることができ、それがこのような大規模な先端径ときれいにカットエッジで確実にピペットを引くのは難しい証明することができますが、ピペットは、ピペットの先端をカットすることなく、直接所望の寸法で引っ張ることができます。

5. 40X目的の下で、電気的に加熱されたフィラメントを用いた5μmの内径にピペットの先端を磨いて発射。完了したら、マイクロピペットは、マウスORNsからの電流を記録するために使用する準備ができました。リンゲル液で満たされたときに開いてピペット抵抗は1MΩ前後となるはずです。

4。嗅覚受容ニューロンの分離

1. 制度ガイドラインと規則に従ってマウスを生け贄に捧げる。 、ヘッドを取り外し剥がれ皮膚が頭蓋骨を覆うと内側に正中線に沿って頭を二等分する。
2. 解剖顕微鏡下で2つの半頭を置き、鼻中隔をやってのけると嗅覚の甲を削除します。グルコースcでシャーレ内のすべての組織を置く哺乳類リンゲル液をontaining。
3. 2甲から、基礎となる軟骨オフ嗅上皮をむき、250μlのリンガーを含むエッペンドルフチュー​​ブに組織を移す。私達は私達の記録室のサイズのセルの右密度を得るために2甲から組織を使用しています。 ℃で後で使用するために4時に残りの組織を保管してください。
4. 渦、中程度の速度で1秒間二回短く嗅上皮を含むエッペンドルフチュー​​ブ。このステップでは、上皮からORNsの機械的解離につながる。
5. 録音室で解離ORNsを含むリンゲル液を置きます。細かい鉗子を用いて懸濁液中にも存在する組織の大部分を削除します。
6. ORNsはリンガーで連続灌流を開始する前に20分間静やレコーディングに進みましょう。

5。録音

1. 録音室にオイルラインに接続されており、regul吸引電極を下げる石油貯留層の高さは、ピペットの先端でわずかに陽圧を確立するために食べました。これは、ピペットから（正圧）または（負圧）に向かって遠ざかっ例えば細胞の破片を観察することによって行うことができます。細胞破片とピペットの先端を汚染しないようにしよう。
2. 20-40Xの倍率を使用して、その代表的なバイポーラ·形態によって認識することができる孤立ORNの録音室をスキャンします。 ORN細胞体の近接に記録電極を移動します。穏やかに細胞体がピペットの先端に入るようにしゃぶり始める。慎重に、かつ徐々に全体の細胞体を浴溶液にさらされる樹状突起や繊毛を残し、吸引ピペットの先端に引き込まれるまで吸引を引き続き適用されます。吸い込まORNsとピペットの形状のイメージについては^7,11を参照^してください。全く吸引が適用されていません一度、ORNは、ピペットの中で移動したり、出ていないことを確認します。そうだとすれば、それに応じてオイル溜まりの高さを調整します。
3. 使い方マニピュレーターは、チャンバの記録部に定住ORNsを含むセクションから吸引ピペットを移動します。溶液交換のための3銃身の筒の前に吸引ピペットを慎重に配置します。 ORNは、このように混合乱流を避ける層流にさらされていると高速溶液交換を達成するように、吸引ピペットは十分近い3銃身の管の開口部に配置しなければなりません。溶液交換を吸引ピペットの先端を流れる液のパラレル·ストリームの間のインタフェースを踏むことによって達成されます。溶液交 ​​換の時間経過は、典型的には、異なるイオン組成の解の間のセル（ 図2参照 ）ステッピングによって誘発接合電流から測定された約20 msである。ソリューションは、重力によって配信されます。

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6。代表的な結果

嗅球における図1）バイポーラ受容ニューロン。 B）の繊毛におけるシグナル伝達機構は、最終的に現在の流入を興奮につながる。その後の脱分極は細胞体における活動電位の発生をトリガーします。

図2は、溶液交 ​​換の速度と信頼性を示しています。ピペットは、通常から100ミリと異なるイオン濃度が記録されたから得られる電流接合のための10％希釈リンガーに足を踏み入れた。黒のトレースはaveのです5試験の激怒、赤はそのSDをトレースします。溶液交換時にSDにはほとんど変化がトライアルからトライアルに溶液交換の信頼性といずれかのソリューション·ストリーム内の過剰雑音の欠如を示しています。

図3は、吸引ピペット技術を用いて、ORNからオイゲノール誘発性応答を示しています。記録上のバーで示されるようORNは1秒間100μMのオイゲノールにさらさ​​れていた。 図。 3A（黒のトレース）は、現在の受容体は幅0でろ過した-現在使用中の受容体を表示するには、50 Hzの図。 （APは、矢印で示されている）も、活動電位を表示するには、5000 Hzの（赤いトレース） - （b）は、現在0の広い帯域でフィルタリングし、同じ記録を示しています。挿入図は、応答の開始時に、より明確にAPを視覚化するために拡大スケールで同じトレースを示しています。

オイゲノール応答性ORNの図4。用量反応家族（）。オイゲノールを0.3μMから100μMの範囲の濃度で使用された、刺激の持続時間は1秒であったとトレースは0でろ過された - 50 Hzです。着臭剤濃度の漸進的増加は、匂い物質への暴露が終了しましたら、またもっとゆっくり終了し、より大型で高速応答、につながった。

ORNsは中間着臭剤濃度（ 図4B）で長時間刺激時の振動応答パターンを表示することができます。ここacetephenone（3μM）応答ORNは8秒間刺激した。刺激の発症小さく、繰り返し応答の一連の高速性と過渡応答のピークの後に観察されています。 50 Hzの - 記録帯域は0でした。

ディスカッション

吸引ピペット技術が同時にORNから臭気誘起遅い受容体電流と高速二相性活動電位を記録するために使用される電気生理学的な手法である。細胞の形質膜が破られていないので、この方法は、付臭剤応答が細胞内因子の細胞質イオン濃度または希釈の変化に起因する変更されていないことを確実に邪魔されずに細胞内の環境を残します。細胞は、長期間（マウスの中の蛙と1時間で最大4時間）のから録音することができます。細胞体は記録ピペットの内側にあるので、この手法のもう一つの利点は、刺激が唯一ORNの先端部に配信されていること、そうであるように繊毛や樹状ノブ（IEです）このように、セル全体が露出した場合に発生する可能性の非特異的効果を排除。セルは比較的よくピペット、高い溶液流量の先端に安定座っにより保護されていますので、高速なソリューションの変更を達成することができるとしても、高流量が簡単にシールが失われる可能性がありタイトなシール記録構成に比べ。細胞内のアクセスが得られていないので、逆に、この技術は研究電位依存性電流をEGにセル電圧クランプするために使用することはできません。それが緩んシール技術であるため、また、録音は様々なソ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料の名称	タイプ	会社	カタログ/ 型番	注釈
空気テーブル	機器	ニューポート
空気ポンプ	機器	ニューポート	ACGP
ピペットプラー	機器	サッター	P-97
ホウケイ酸ガラス	機器	WPI	1B150-4
ニコン倒立顕微鏡エクリプス	機器	ニコン	TE2000U	Hgランプ、GFPフィルターや目標少なくとも20Xと5X装備
アンプのPC-501A	機器	ワーナー	64から0008	ヘッドステージ1GΩ
ダイヤモンドナイフ	機器	カスタムメード
デジタイザMikro1401、A / D	機器	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン
フィルタユニット3382	機器	クルーンハイト法人
信号	ソフトウェア	ケンブリッジ·エレクトロニック·デザイン
Ag / AgCl電極ペレット成形	機器	WPI	64から1297
ピペットホルダ	機器	ワーナー	64から0997	カスタムは、適合するように変更 ヘッドステージ
記録室	機器	カスタムメード
極微操作装置 MP85-1028	機器	サター·インストゥルメント	極微操作装置 MP85-1028
鉱油	ソリューション	シグマ	330779-1L
オシロスコープのTDS 1001	機器	テクトロニクス
三連発四角いガラス管	機器	ワーナー	64から0119	5センチメートル長い0.6ミリメートルのID、
バルブ	機器	リー·カンパニー
Valvelink 8.2	機器	科学自動化
SF-77B潅流高速ステップ	機器	ワーナー