方法論記事

マウスの中枢神経系における幹細胞注入のマルチモーダルイメージング

DOI：

10.3791/3906

⸱

2012年6月13日

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1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

死後組織学的分析をin vivoで生物発光および磁気共鳴イメージング（I）、及び（ii）この記事では、使用して、齧歯類の脳における細胞移植のマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適なシーケンスを説明しています。単一の動物でこれらの画像診断法を組み合わせることで高分解能、感度と特異性を有する細胞の移植を評価することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去10年間の間に、幹細胞移植は、病気、前臨床および臨床試験の両方の様々なプライマリまたはセカンダリの治療法として注目を集めています。しかし、機能的転帰、および/または組織再生、次の幹細胞移植に関する結果を最新の状態には非常に多様である。一般的に、臨床的利益は、基礎となるメカニズム（S 1）の深遠な理解せずに観察される。したがって、複数の努力が正確に移植した幹細胞及び/又はそれらの微小環境の生存、運命学と生理学を評価するための究極の目的とした移植幹細胞を監視する別の分子イメージングモダリティの発展につながっている。分子イメージングによって決定される1または複数のパラメータで観察された変化は観察され、臨床効果に関係している可能性があります。この文脈において、我々の研究は、生物発光イメージングの併用（BLI）、磁気共鳴イメージング（MRI）や組織学的analysiに焦点を当てる移植幹細胞を評価するための。

BLIは、一般的に（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する細胞は、その基板の光は、次の相互作用を放出することができる生化学的反応に基づいて、非侵襲的に細胞の追跡を行い、移植2月7日以下の時間での細胞生存率を監視するために使用されます例えば、D-は、ルシフェリン）8、9。一方、MRIは10、臨床的に適用される非侵襲的手法であり、その感度は非常にMRI造影剤による細胞標識後に生成されたコントラストに依存しますが、正確には非常に高い分解能11月15日で細胞の移植を見つけるために使用することができます。最後に、事後組織学的分析は、最高の解像度と感度で非侵襲的手法で得られた研究成果を検証するための最適な方法です。また、エンドポイント組織学的分析は、Ba、私たちは移植した細胞および/または周囲の組織の詳細な表現型の解析を実行することができます蛍光レポータータンパク質および/または特異的抗体との直接的な細胞標識の使用上のSED。

要約すると、我々はここで視覚的に別の幹細胞および/または環境関連マウスの中枢神経系に移植幹細胞を次のような特徴を解明するためにBLI、MRIおよび組織の補完性を示しています。青色蛍光ミクロンサイズの酸化鉄粒子（MPIOs）は、グラフトされたされると遺伝的に強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）とホタルルシフェラーゼ（fLuc）を発現するように設計、および標識された例として、骨髄由来のストローマ細胞、免疫有能なマウスと結果のCNS ​​は、BLI、MRIと組織像（ 図1）によって監視されます。

プロトコル

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1。細胞調製

  1. 実験は、遺伝的にルシフェラーゼ及びEGFPレポータータンパク質を発現するように設計ex vivoで培養された幹細胞集団を使用して開始する必要があります。ここでは、前述のBergwerf ら 2、図5によって説明/ルシフェラーゼのeGFPを発現するマウス骨髄由来ストローマ細胞（BMSC-Luc/eGFP）を使用します。
  2. 1μg/ mlのPuromycineを添加した15ミリリットルの完全増殖培地（CEM）のT75培養フラスコごとに8×10 5細胞の密度で細胞標識、プレートBMSC-Luc/eGFP細胞の二日前。
  3. 細胞は℃、5％CO 2で37 48時間成長することができます。
  4. 成長細胞培養（：T75培養フラスコに15 mlの培養液あたり75×10 6粒子の合計）に5×10 6氷河ブルーミクロンサイズの酸化鉄粒子（GB MPIO）ml当たり培地を追加します。
  5. エンドサイトーシスを介した粒子の取り込みを可能にするために16時間インキュベートします。
  6. 残りの粒子を洗い流すそして細胞はギガバイトMPIOの細胞コンフルエントと均一な分布を得るためにさらに24時間のために成長することができます。
  7. のeGFP +細胞の総量のeGFP +およびGB MPIO +細胞の割合をカウントすることにより、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に粒子の取り込みを検証します。
  8. トリプシン-EDTA処理（5分間T75培養フラスコあたり5 ml）の後10 mlのPBSと収穫細胞を二回ギガバイトMPIO標識BMSC-Luc/eGFP細胞を洗浄します。
  9. 採取した細胞を洗浄し、PBSで133×10 6細胞/ mlの最終濃度で再懸濁します。
  10. 移植まで氷上で細胞を維持する。

2。マウスの中枢神経系における細胞移植

  1. ケタミンの腹腔内注射（80 mg / kg体重）+キシラジン（16 mg / kg）を混合することによってマウスをAnaesthetize。
  2. マウスは眠りに落ちるようにする5分間待ちます。
  3. 無菌操作を可能にするために、マウスの頭を剃る。
  4. 定位フレームにマウスを置きます。
  5. Desinfect皮膚や脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らす。
  6. 頭蓋骨を露出させる正中頭皮の切開を行い、与えられた座標に歯科用ドリルバリを使って頭蓋骨に穴ドリル：後部2ミリメートルとブレグマに横方向の2ミリメートルです。
  7. 簡単に渦細胞懸濁液を、シリンジで細胞懸濁液を吸引除去する。
  8. 硬膜の下に2.5mmの深さに注射針を置き、1分間の圧力平衡を可能にします。
  9. 自動マイクロインジェクションポンプを用いて、硬膜下2mmの深さで、0.70μL/ minの速度で3μlの細胞懸濁液（4×10 5細胞）を注入します。
  10. 注入された細胞懸濁液の逆流を防ぐために、さらに5分間待ちます。
  11. 徐々に針を撤回し、皮膚を縫合する前に、皮膚の境界線を消毒する。
  12. 脱水を防ぐために、皮下に300μlの0.9％NaCl溶液を注入し、麻酔から回復するための加熱ランプの下にマウスを置きます。 pを管理OST-手術機関の規格に準拠した鎮痛剤。

（3）in vivoでの生物発光で

  1. イソフルランと酸素の3％の混合物でマウスをAnaesthetize。
  2. フォトンイメージャーでマウスを配置し、イソフルランと酸素1.5％に麻酔レベルを減らすことができます。
  3. 静脈内に体重kg当たり150 mgのD-ルシフェリンを注入します。
  4. 写真Visionソフトウェアを使用して、5分間の画像を取得します。
  5. M3visionソフトウェアを使用して画像処理を実行します。興味の固定領域を使用して観測信号を定量化する。

（4） 生体磁気共鳴イメージング

  1. N 2 O（3:7）：O 2の混合物中のイソフルラン3％のマウスをAnaesthetize。
  2. 水平方向の9.4T MRシステムの制止にマウスを置き、O 2の混合物中のイソフルラン1％に麻酔レベルを低減：N 2 O（3:7）。
  3. 脱水を防ぐためにマウスの眼を濡らするには、マウスの腹の下にセンサーを配置することによって、体温をモニターし、呼吸数を監視するために直腸プローブを接続します。
  4. 110±1分あたり10回の呼吸で呼吸を維持し、±0.5 37℃の狭い範囲内で体温を一定に保つ
  5. マウスヘッドとの位置磁石の中央にマウスの上に表面RFコイルを配置します。
  6. 70μmの2の面内分解能を持つ幹細胞の移行を検討するために、特定の解剖学的情報を得るための10の冠状T2強調スピンエコー（SE）のイメージのセットを取得し、T2 *強調グラディエントエコー（GE）の画像。次のように配列パラメータを設定します。繰り返し時間（TR）：500ミリ秒、エコー時間（TE）：8ミリ（GE系列）と繰り返し時間（TR）：4200ミリ秒、エコー時間（TE）：12.16ミリ秒（SEシーケンス）。視野（FOV）：18×18 mm 2で 、マトリクス：256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離（Paravision 5.1ソフトウェア）。
  7. データ処理を実行します。アミラ4.0ソフトウェアを使用します。

5。死後組織学

  1. イソフルラン（4％）、酸素（0.5 L / min）と窒素（1 L / min）で2分間混合物の吸入により、非常に深くマウスをAnaesthetize。頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。
  2. 頭蓋骨から、マウスの脳を取り出して、2時間PBS中4％パラホルムアルデヒド中で脳組織を固定。
  3. スクロースの異なる勾配で続いて脳を配置することによって、脳組織を脱水：PBS中20％スクロース中で一晩、PBS中の10％ショ糖でPBS、2時間で5％スクロース、2時間。
  4. 液体窒素を用いて脳組織を凍結し、切片まで-80℃で組織を格納します。
  5. クライオスタットを用いて厚さ10μmのセクションのセクション脳組織。
  6. 画面はGB MPIO粒子と蛍光顕微鏡を用いたeGFPを発現する細胞からの緑色蛍光から青色蛍光のために凍結切片を無染色。
  7. 画面には、のために凍結切片を無染色炎症性細胞からの赤/緑バックグラウンドの蛍光。
  8. 携帯移植と相互作用する内因性の細胞集団（例えば、ミクログリア、アストロサイト、T細胞、...）を識別するために、さらに免疫組織化学的および免疫蛍光染色を行います。

6。代表的な結果

ここでは視覚的にマウスの中枢神経系におけるルシフェラーゼ/ EGFPを発現する（幹）細胞集団の成功したマルチモーダルイメージングのためのイベントの最適な順序を提示した。最初に、簡単に検証することができますBMSC-Luc/eGFP細胞の非常に効率のよいラベリングに記載さギガバイトMPIOラベリング手順の結果は、蛍光顕微鏡（ 図2A）を使用します 。マウスの中枢神経系にBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた次の、GB MPIOの移植時に、細胞の移植片の生存率はルシフェラーゼ活性（ 図2B）に基づいて生体内 BLI で監視することができます。さらに、移植細胞の正確な局在は、 生体内で監視することができます図2C）の鉄含有量に基づいています。最後に、組織学的分析は、BLIとMRIにより得られた結果の検証を可能にします。安定した生存率は時間内に安定したEGFP発現（ 図2D）により確認された。このためには、青色蛍光MPIOとのeGFP発現細胞の局在は、ローカリゼーションと移植した細胞の生存率の正確な測定が可能になります。さらに、幹細胞のこの二重蛍光標識は、5炎症性細胞によって作成されたバックグラウンドの蛍光に基づいて、偽陽性の結果を観察する可能性を減らすことができます。

figure-protocol-1
図1処理シーケンスの概要

  1. 細胞標識：BMSC-Luc/eGFPはmlの培養液あたり5×10 6ギガバイトMPIO粒子で標識されています。インキュベーション、24時間以下の残りの期間の16時間後、細胞をのために収穫される脳内注入。
  2. 細胞移植：ブレグマ-2 mmで硬膜下の正中線と2 mmから2 mmの右：GB MPIOはBMSC-Luc/eGFPは、次の座標にマウスの脳に移植されているラベル。
  3. 生体 BLI の場合 ：150 mgのD-luciferin/kg体重以下の静脈内投与は、生成された光は、フォトンイメージャを使用して5分の間に買収されました。
  4. 生体内 MRI で 70μmの2の面内分解能10コロナのT2強調スピンエコー（SE）の画像とT2 *強調グラディエントエコー（GE）の画像のセットが取得された。シーケンスパラメータは以下の通りであった繰り返し時間（TR）：500ミリ秒、エコー時間（TE）：8ミリ（GE系列）と繰り返し時間（TR）：4200ミリ秒、エコー時間（TE）：12.16ミリ秒（SEシーケンス）。視野（FOV）：18×18 mm 2で 、マトリクス：256×256、1ミリメートルのスライス厚1 mmのスライス分離。
  5. 事後組織：10μmの厚さの凍結切片を発現しているEGFPおよび青色蛍光標識されたBMSC uのためのスクリーニングを行った蛍光顕微鏡を歌う。

figure-protocol-2
図2幹細胞移植のマルチモーダルイメージング

  1. 氷青（GB）MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの直接免疫蛍光顕微鏡検査法。
  2. 4×10 5ギガバイトMPIOを注射したマウスの in vivo BLI で移植後1週と2週目BMSC-Luc/eGFP細胞を標識した。第1週と2週後の移植で検出されたBLI信号の統計的分析。データは5分の期間から平方センチメートル当たりステラジアンあたりの毎秒の光子数の平均値（PH / S / SR / cm 2）のように表される+ / -クリアBLI信号を示すマウスに関心の固定領域から計算された標準誤差注射部位。
  3. コロナの二次元ギガバイトMPIOのMRIラベルBMSC-Luc/eGFP（左のパネルは、（i）T2強調スピンエコー画像と、（ii）T2 *強調グラディエントエコー画像）とBMSC-Lラベルが付いていないUC / EGFP（右パネル：（III）T2強調スピンエコー画像、および（vi）T2 *強調グラディエントエコー画像）をマウス脳に移植。
  4. ギガバイトMPIOの組織学的解析では、2週後の移植でBMSC-Luc/eGFPインプラントを標識した。 eGFPを発現し、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFP移植のローカライズは、（i）直接免疫蛍光分析。 （ii）の高倍率の詳細（I）。 （ⅲ）GFAP抗原に対する免疫蛍光染色、GB MPIOラベルBMSC-Luc/eGFPの周囲のアストロサイトの瘢痕組織の発展を示す。ギガバイトMPIOのIBA-1抗原、侵略を示すと周囲のために（VI）の免疫蛍光染色は、ミクログリアによってBMSC-Luc/eGFPのラベルが付いた。

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ディスカッション

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本稿では、免疫有能なマウスの中枢神経系の細胞のインプラントの詳細な特性のための3つの相補的なイメージングモダリティの組み合わせ（BLI、MRIおよび組織）のために最適化されたプロトコルを記述します。レポーター遺伝子ルシフェラーゼ及びEGFP、およびGB MPIOとの直接的な細胞標識と遺伝的改変に基づく細胞のレポーター遺伝子標識の組み合わせは、in vivoで幹細胞移植の正確な評価につながります。

アニオン性表面（カルボキシル代替）との組み合わせでBMSCの粒子ラベリング、GB MPIO粒径（1.63μm）のために16から18の非貪食細胞によるこれらの粒子のエンドサイトーシスの取り込みを容易にするために提案されている。しかし、それは高い標識効率を得るためのインキュベーション時間は細胞の種類に依存することに言及する必要があります。例えば、貪食細胞（マクロファージや樹状細胞など）をより迅速に、これらの粒子を内部化することができます（0.5のインキュベーション時間 - 1時間）効率のよいラベリングには最低限16時間のインキュベーション時間を必要とす...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、利害の衝突を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者の仕事は研究助成金G.0136.11とG.0130.11（AVDL、ZBとPPOに付与されている）と1.5.021.09で、アントワープ大学の研究助成ID-BOF 2006（PPOとAVDLに付与されている）によってサポートされていました。 SBO研究助成金IWT-60838によって科学研究フランドル基金のN.00（PPOに付与されている）（FWO-ブラーンデレン、ベルギー）：科学と技術のためのフランドル研究所BRAINSTIM（ZBとAVDLに付与） EC-FP6-NOE DiMI（LSHB-CT-2005から512146）、EC-FP6-NOE EMIL（LSHC-CT-2004から503569）によって部分的にフランダース政府からMethusalem研究助成金（ZB​​に付与されている）によって部分的、 、およびInter大学の観光地ポーランドでIUAP-NIMI-P6/38（AVDLに付与されている）。ナタリー·デ·VochtはFWO-ブラーンデレンから博士 - 学生の身分を保持しています。ピーターPonsaertsはFWO-ブラーンデレンのポストドクトラルフェローです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名前 会社 カタログ番号 コメント
IMDM ロンザ BE12-722F 細胞増殖培地、CEMのコンポーネント
ウシ胎仔血清ギブコ 10270-106 細胞増殖培地、CEMのコンポーネント
ウマ血清ギブコ 1605-122 細胞増殖培地、CEMのコンポーネント
ペニシリン - ストレプトマイシンギブコ 15140 細胞増殖培地、CEMのコンポーネント
ファンギゾンギブコ 15290-018 細胞増殖培地、CEMのコンポーネント
PBS ギブコ 14190
Puromycine Invivogen ANT-PR-1
トリプシンギブコ 25300
ギガバイトMPIO 前髪研究所 ME04F/7833
D-ルシフェリンプロメガ E1601
ケタミン（ケタラール） ファイザー
キシラジン（Rompun） バイエルヘルスケア
イソフルレン Isoflo 05260から05
0.9％NaCl溶液バクスター
パラホルムアルデヒドメルク 1.04005.1000
スクロース Applichem A1125
マイクロインジェクションポンプ KD科学的 KDS100
フォトンイメージャ Biospaceラボ
9.4T MRスキャナブルカーバイオスピン Biospec 20分の94 USR
BX51顕微鏡オリンポス BX51
Mycrom HMクライオスタット Prosan HM525
注射器ハミルトン 7635から01
30ゲージの針ハミルトン 7762から03
フォトビジョンソフトウェア Biospaceラボ
M3visionソフトウェア Biospaceラボ
Paravision 5.1ソフトウェアブルカーバイオスピン
アミラ4.0ソフトウェア顔イメージング

参考文献

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