のためのシステム<em&gt; ex vivoで</em胚膵臓&gt;培養

サマリー

ここでは、マウス胚性膵臓の分離、培養および操作のための方法を説明します。これは、優れたを表し ex vivoでシステム。膵原外植片は、数日間培養し、ホールマウント蛍光免疫とライブイメージングなど、さまざまなアプリケーションの範囲で使用することができます。

要約

膵臓は消化酵素の生産と血糖値¹の規制を含め、私たちの体の重要な機能を制御します。過去10年間に多くの研究では、膵臓の器官形成を理解するための強固な基盤に貢献してきたが、重要なギャップが早期膵臓形成の²の我々の知識に固執する。これらの初期のイベントの完全な理解は、この臓器の開発への洞察を提供するだけでなく、糖尿病や膵臓癌などの膵臓をターゲット難病、になります。最後に、この情報は、糖尿病との関連で、細胞補充療法を開発するための青写真を生成します。

胚発生時、膵臓はマウス胚における^3,4日胚（E）は9.5で、背側と腹側前腸内胚葉の異なる胚の増生に由来する。両方の派生物は、固体として周囲の上皮間葉に裏返しにする完全に成熟した器官^2,5,6を生成するために、分岐や分化、増殖を受けるリットルの芽、。最近の証拠は、インスリン産生β細胞を含む膵臓細胞系譜、の成長や分化、分岐膵臓上皮^7,8内の適切な組織アーキテクチャ、上皮リモデリングと細胞の位置に依存していることを示唆している。しかし、分枝形態形成方法と発生し、膵臓の増殖と分化との間で調整されているほとんど知られていない。これは、形態形成のイベントは非常に動的でありながら、これらの発達過程に関する現在の知識は、固定された試料の分析にほぼ独占的に依存してきたという事実のために一部になっています。

ここでは、開発膵臓（ 図1）の直接可視化を可能にするガラスボトムディッシュ上でex vivoで解剖し、培養マウス胚膵芽する方法について検討する。このカルトUREシステムは、理想的には、特に、ライブセルイメージング共焦点レーザー走査顕微鏡と、ために考案されています。膵臓外植片だけでなく、野生型マウスの胚から調製しただけでなく、遺伝子組み換えマウス系統（ 例えば、トランスジェニックやノックアウト）から、変異体の表現型のリアルタイムの研究を可能にすることができます。また、このex vivoで培養系は 、増殖、成長、伸長、分岐、細管形成と分化に関する定量的なデータを取得できるように、膵臓の開発に化学化合物の効果を研究するために貴重なものです。結論として、高分解能イメージングを組み合わせるex vivoでの膵臓移植片培養法の開発は、彼らが開発したマウス胚の中で発生した形態形成と分化のイベントを観察するための強力なプラットフォームを提供します。

プロトコル

ここで説明されたプロトコルは、もともとパーシバルとスラック⁹に記載されており、共焦点顕微鏡検査用に最適化手法から適応されています。

1。グラスボトム培養皿のコーティング

次の手順は、層流フード内の無菌条件下で行われるべきである。

1. 膵臓外植片を直径20mmガラス底マイクロウェル（ 例えばマテック株式会社）と35mmのペトリ皿で培養される。片培養当たりと文化の全期間1ガラスボトムディッシュを使用しています。膵芽の解剖と分離前日に、フィブロネクチンでコートガラス底マイクロウェル。
2. 50μg/ mlの最終濃度になるように細胞培養グレードの水で滅菌フィブロネクチンを希釈し、全体のガラスの表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェル（ 図1E）にそれ（〜150μL）の最小ボリュームを追加します。皿を置き一晩インキュベーションし、4℃の冷蔵庫インチ
3. 解剖当日、フィブロネクチンを吸引し、細胞培養グレードの水でウェルを洗浄し、ペニシリン/ストレプトマイシン（1％）を補充BME（イーグル基礎培地）培地150μlの最低限のボリュームを追加、グルタミン（1％ ）、50μg/ mlのゲンタマイシン[解剖ミディアム]。プレート外植片をする準備ができるまで、層流フードでコーティングされた料理を残す。

すべてではないフィブロネクチンコートディッシュが使用されている場合、それらは4℃で1週間用に保存することができます料理は、乾燥解剖ミディアムを埋めて、冷蔵庫にそれらを配置させてはいけない。

フィブロネクチンに加えて、膵臓の外植片は正常ラミニン^9、マトリゲル^10,11または微多孔膜¹²として、様々な基板上に培養されている。なぜなら分岐への影響のため、我々は、基板としてフィブロネクチン^9を使用^します 。

2。 Dの解剖E11.5からorsal膵原 - E12.5マウス胚

1. 胎生（E）は11.5または12.5にtimed妊娠雌マウスを屠殺し、胚は、以前の70％エタノールで洗浄解剖器具を使用して収集されます。 50μg/ mlのゲンタマイシンを補充した氷冷PBSを含む10cmのプレートで子宮切開を置きます。
2. そっとはがし、小さなハサミやデュモン鉗子を使用して、個々の胚セグメントに上記、個別子宮、子宮の筋肉からの照明付き実体顕微鏡下と脱落膜に囲まれている個々の胚を、削除してください。胚を露出させ、卵黄嚢と羊膜を除去するために^13個の標準胚の解剖技術を使用しています。その後、胚の上体（肝臓上）とテール領域を削除します。これは、内部器官（ 図1B）の露出をできるようになります。氷のように冷たいBME郭清培地を含む10cmのプレートに胚の中間体を転送します。
3. 今可視化し、実体顕微鏡下で背膵原を解剖するために下からのみ透視を使用しています。優しく、鉗子で横切開を行うことによって、胚の半ば身体を開きます。胃と脾臓の位置を確認します。背膵原は、胃の後方領域（ 図1C）に横方向に取り付けられている。デュモンピンセットを用いて、例えば胃、脾臓などの隣接する構造から、背側膵原を離れて解剖したが、（ 図1D）上皮間葉の周りにいくつかを残す。ガラスパスツールピペットを用いて、10％ウシ胎児血清を添加した冷たいBME郭清培地[培地]を含む35mmのペトリ皿に孤立したつぼみを転送します。すべての膵臓が隔離されるまで、これらのステップを繰り返します。異なる遺伝子型の膵臓が分離されている場合は、ヌンク4ウェルプレートを用いて分離し、それらを保つ。

3。膵臓外植片のめっきと文化

ファイナルプラットフォーム外植片のINGは文化の物理的な動きを最小限にするために組織培養室および/または組織培養インキュベーターに近接して行われる。

1. 層流フード内で無菌条件下でBME培地の〜150μlを37℃に予め温め℃でフィブロネクチンコートマテック皿のBME解剖媒体を交換
2. 慎重に、ガラスパスツールピペットを用いて長期培養用の被覆マテック皿（皿当たり1外植片）に膵臓外植片を移す。培養中に拡散を保証するために、外植片を取り囲む間葉が若干細い針で、必要に応じて、リッピングすることができます。
3. 数時間外植片は、ガラス底マイクロウェルにアタッチできるように、静かに、インキュベーター（5％CO _{2、37℃）、}組織培養において培養を置く。一度、それらが結合している、BME培地2mlの37℃予め温め℃に1.5mlでマテック料理を埋める解剖の日を0日目とも呼ばれます。
4. マン膵臓外植培養のipulationは、層流フード内の無菌条件下で行われる。実験的な要件が異なるタイミングを（化学剤による外植片の例インキュベーション）を指示しない限り、BME培地は、一日おきに変更されます。外植片は最大一週間に5日間、この状態で培養することができる。

4。膵臓外植片のためのホールマウント蛍光免疫染色プロトコール

免疫プロトコルの全ての工程は（イメージングへの固定​​から）プラスチックボトムディッシュよりも優れた画像が得られ、同じマテック皿、中で行われる。固定後、膵臓外植培養は、無菌条件下で維持する必要はありません。

1. BME培地を吸引除去し、2ミリリットル1X PBSで一回外植片を洗う。
2. 植固定に2ミリリットル氷冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）を含むPBSを交換し、氷上で20分間皿を置きます。時間からプレートを静かに回し時間が、外植片を切り離す可能性があるので、ロッキングプラットフォームを避ける。
3. PFAを取り外し、室温（RT）で10分ごとに、1×PBS 2mlを植3回洗浄する。
4. 室温で少なくとも30分間、2ミリリットルブロッキング溶液（1×PBS +0.1％トリトン-X + 3％ロバ血清）でブロック。
5. ブロッキング溶液中で一次抗体を希釈し、4℃で一晩インキュベーション全体植体表面を覆うマテックプレートの20mmのマイクロウェルに直接希釈の〜150μlを加える℃まで物理的な動きを最小限に抑えるために、直接、寒い部屋（4℃）で外植片に一次抗体を加える。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。
6. 翌日は、抗体溶液を除去し、室温で30分ごとに+0.1％のTween-20（PBT）を2ミリリットル1X PBSで3回洗浄する。
7. ブロッキング溶液中で二次抗体を希釈し、[製造元の推奨に従って、私たちはロバのAlexa Fluor染料の二次抗を使用する1:750希釈で体]、暗所で室温で1〜2時間のインキュベーションのための全体の外植片表面を覆うマテックプレート、20 mmのマイクロウェルに希釈するの〜150μlを直接追加します。核の対比については、二次抗体の希釈と共にヘキストが含まれています。蒸発を防ぐために、抗体を添加する前に、湿潤チャンバーにマテックプレートを配置します。
8. 室温で30分ごとに2ミリリットルの1X PBS +0.1％のTween-20（PBT）で3回洗浄する。
9. マウントする前に、Tween-20を除去するために1×PBSで1回洗浄します。マテックプレートの20mmのマイクロウェルに水性封入剤（抗退色付き）1滴を加えることによって、マウントします。優しく、カバーガラスとの外植片をカバーしています。気泡を避けてください。
10. マテックプレート上の外植片は、実験の目的に応じて、標準的な位相差顕微鏡や共焦点顕微鏡下で観察することができます。共焦点顕微鏡分析のために私達はツァイスLSM 700反転設定を使用します。私たちは、フルオロフォアの適切なレーザーを設定エド。画像膵臓外植片の所望の領域を務める目標を選択します。 10Xの水浸対物レンズは、視野内全体外植片を保持するのに適しています。 40X水または油浸目標は高い分解能を持つ膵臓外植片の特定の領域に焦点を当てるのに適している。外植片は、光学的に区分された後、取得したZ-スタックが適切なソフトウェアを使用して、3Dで再構築することができます。

5。膵臓外植片の生細胞イメージングプロトコル

1. 環境室の設定：環境エンクロージャと小さなインキュベーションチャンバーを使用する顕微鏡ステージ上に座っている[温度とCO ₂制御で]。胎児の膵臓の適切な培養は37℃、加湿した5％CO ₂の制御された雰囲気の安定した温度を必要とします。適当なチャンバーはいくつかのベンダから提供されています （ 例えば 、ツァイス、ニコン、オリンパス）。ヒーターボックスを組み立て、それをオンにイメージングの前にトン少なくとも1時間は、機器のウォームアップと5％CO ₂含有量を平衡化することができますを開 ​​始します。
2. 膵臓外植培養のタイムラプスイメージングのために、私たちはツァイスLSM 700倒立顕微鏡を使用しています。レーザーと客観の選択についてポイント4.10を参照してください。
3. 膵臓外植片は、ライブイメージングを開始する前に、よくガラスボトムディッシュに付着してみましょう。 [私たちは通常、1日目に始まるライブイメージングを行う]。
   層流フードでは、最適な栄養条件で開始するために新鮮なBME培地に植培地を吸引し、交換してください。
4. 優しく顕微鏡室に外植片を転送し、共焦点顕微鏡の試料ホルダーにインキュベーションチャンバー内にマテック皿を置きます。
5. 目的を準備（ 例えば浸対物レンズの選択に応じて油または水培地を追加）し、外植片の関心領域に焦点を当てる。適切に環境室を閉じます。タイムラプス中の蒸発を防ぐために水の代わりに水浸目標と買収は、それが（ 例えばツァイスImmersol W）が市販されている粘性の液浸の液体を使用することをお勧めします。
6. レーザー強度、Zスタック取得パラメータと時間間隔（これもトラブルシューティングのための議論を参照）を設定します。実験を開始します。
7. イメージング、輸出Zスタックおよびすべての時点の後にして、適切なソフトウェア（ 例えば ImageJは、Volocity、Imaris、ホイヘンス）を使用してそれらを分析する。

6。代表的な結果

背側膵芽は（一緒に周囲の間葉付き）E11.5およびE12.5間のマウス胚から解剖し、ガラス底培養皿（ 図1）に直接播種した。血管が上皮を取り巻く間充織に存在し、血管内皮マーカーPECAM ^12（データは示さず）に対する免疫染色により可視化することができる。培養の2日後、膵臓外植ウント飛躍的な成長をerwentとその核膵転写因子陽性であった分枝上皮構造、PDX1（ 図2A-C）に自分自身を整理し始めた。文化の3日目の膵外植片の平均Z-厚さは60〜80μmである。外植片の表面とボリュームが適切なソフトウェア（ 例えばホイヘンス）を用いて測定することができます。形態および免疫蛍光分析は、膵臓外植片は 、in vivo早期膵臓分化と形態形成イベント^{5,10,11,14（} 図2） で再現 、このプロトコルを使用して培養することを示した。培養4日に膵臓外植片は、典型的な"チップとトランク" CPA1を表示上皮⁸の分離、+トランク内部クラスタとして編成上皮枝（ 図2C）と差別化されたインスリン+およびグルカゴン+細胞の先端の前駆細胞（ 図2Dを受け）。さらに、pancreatiex vivoで培養中のc上皮は基底膜（赤図2E）で頂端F-アクチンの局在（ 図2E、緑）およびb1インテグリンと共に、適切な細胞骨格の組織と細胞極性を示した。

（ 図3）、リアルタイムで分岐膵臓を研究するために、胚性膵臓外植片は、デュアルカラー蛍光レポーターマウス系統membrane-Tomato/membrane-Green ^15（マウス系統は、ジャクソン研究所で利用可能ですMT / mg）を単離した。まだ培養で増殖させたMT /ミリガウス膵臓外植片のタイムラプスムービーからフレームは図3に示します。膜構造をMT蛍光タンパク質の局在は、細胞の形態の概要を説明し、時間をかけて細胞のリモデリングおよび移行を追跡できるように、微細な細胞プロセスの解決が可能になります。

12時間タイムラプス実験後mTの蛍光シグナルは、生存可能とし、VIのまま光損傷（ 図3）に起因する可能性が最も高い、その強度が減少しているにもかかわらず、CTableの。光損傷と光毒性を回避または低減するための技術的な解決策が議論のセクションで説明します。

図1 E12.5マウス胚から背側膵臓芽解剖の模式図。 E12.5マウス胚の（A）の明視野像。胚（肝臓上）と尾部の上体は、中間体（B）を分離するために削除されます。切開は赤の点線で示されている。胃や十二指腸領域の露光（点線のボックスで示されている）の（C）さらに解剖の結果。背膵原（赤点線の丸で囲んだ部分）、胃と脾臓原基の隣の基地である。解剖背側膵臓芽（D）は、BME培地（Eを含有するガラスボトムディッシュのマイクロウェルにパスツールピペットを用いて転送されます、F）。略語：STO（胃）、SP（脾臓）、DP（背膵原）、デュオ（十二指腸）。スケールバー、1000μmの（A、C）。

図2：膵臓外植培養のホールマウント共焦点免疫蛍光分析。 1日目および ex vivo培養の2日目に膵臓外植片の（A）の明視野像。赤い点線は、上皮の分岐の開始を示します。 （B）はホールマウントの3D再構成は、3日目の膵文化にPDX1に対する免疫染色。膵臓外植培養の48時間で広範な分岐を受けPDX1 +細胞の細管を示した。側底膜マーカーE-カドヘリン（ECAD）、先端の前駆マーカー、カルボキシペプチダーゼ1（CPA1）およびホスホ - ヒストンH3（pHH3）に対する抗体を用いた3日目の膵外植片の（C）はホールマウント免疫染色。活発な細胞分裂pHH3 +細胞のほとんどはCPA1 +細胞による末梢先端に局在。破線リットルINESは、枝の先端を示す。内分泌系統マーカー、インスリン（INS）と3日目にグルカゴン（Gluca）の（D）のホールマウント免疫染色。黄色の矢印は、INS +とGluca +細胞のクラスターを示す。内分泌細胞クラスタのいずれかの高倍率、（D '）をはめ込み。 PDX1、β1インテグリン（β1int）とF-アクチン（ファクト）の3日目膵臓外植片の（E）ホールマウント免疫染色。 PDX1陽性上皮細胞間に散在間葉系細胞（アスタリスク）。 C、D、およびEに示されている画像は、Zシリーズの単焦点光学セクションです。スケールバーは100μmを（A、B）は、50ミクロン（CE）。

図3 のex vivo培養膵臓外植片の代表的なライブセルイメージング。 MT /ミリガウストランスジェニックマウス胚から膵臓外植片のタイムラプスムービーから（AD）のフレーム。分：撮影時は時間単位で表示されます。外植片は、1日目から始まる画像化した。 Zスタック画像40X油浸対物レンズと15時間の合計ごとに12分を取得した。破線は、上皮と間充織間の分岐と境界の一角を示す。スケールバーは、50μmである。

ディスカッション

膵臓運命が指定されると、膵臓前駆細胞は、最終的に成熟しており、機能的な臓器^2,4を形成するために大規模な増殖、分化、形態形成を受ける。現時点では、分岐方法は、膵臓で行われ、それがどのように前駆細胞の増殖と分化に接続されているほとんど知られていない。膵臓外植培養は 、ex vivo ^5,9,11、これらのプロセスを解明するための理想的なシステムを表します。早い膵芽の ex vivo での外植片とライブセルイメージングを組み合わせることにより、1は、胚における膵臓の形態形成時に発生するイベントの鮮明な画像を得ることができます。この動画の記事はホールマウント蛍光免疫とライブイメージングに最適ですガラス支持、上胚膵臓の ex vivo培養を確立する単純なアプローチを提示している。

イメージングcに対するex vivoでの膵臓外植片の使用の多数の例エルの形態、増殖と分化がここに提示されています。重要なのは、これらの例は、胚がこのプロトコルを用...

材料

試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
抗体： カルボキシペプチダーゼ E-カドヘリン F-アクチン グルカゴン インスリン β1-インテグリン PDX1 PDX1 ホスホヒストンH3	ABD Serotec社 インビトロジェン 分子プローブ ImmunoStar ミリポア ミリポア アブカム ハイブリドーマ銀行 細胞シグナリング	1810-0006 13から1900 - 12373 20076 4011から01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
基礎培地イーグル（BME）	シグマ	B1522-500ML	無菌状態に保た
細胞培養グレードの水	PAA	S15-012	無菌状態に保た
培養皿（ガラス底）、35 mmの	マテック株式会社	P35G-0-20-C
ロバ血清	ケミコン	S30-100ミリリットル
ウシ胎児血清ゴールド	PAA	A15-151	無菌状態に保た
フィブロネクチン	インビトロジェン	330100から8	株式ゾル。細胞培養グレードの水に1 mg / mlの
ゲンタマイシン	インビトロジェン	15750-037	無菌状態に保た
グルタミン	インビトロジェン	25030-024	無菌状態に保た
4ウェルMultidishes	ヌンク	176740
顕微鏡： 倒立共焦点顕微鏡（LSM 700） 実体顕微鏡（ディスカバリーV12）	ツァイス ツァイス		目的： C-アポクロマート0.45 / 10X W M27（work. DIST 1.8ミリメートル;撮像深度〜100ミリメートル）、C-アポクロマート1.2 WコアーM27（work. distの0.28ミリメートル。〜撮像深さ50μm）/ 40X 上から下および光ファイバ照明から透視
パラホルムアルデヒド	ロート	0335.3	原液20パーセント
パスツールピペット（ガラス）、150ミリメートル	VWR	HECH567 / 1
ペニシリン/ストレプトマイシン	PAA	P11-010	無菌Cに保たonditions
ペトリ皿、60ミリメートル	グライナーバイオワン	628102
ペトリ皿、35ミリメートル	グライナーバイオワン	627161
1×PBS、pH7.4の	PAA	H15-002	無菌状態に保た
春はさみ8ミリメートルブレードが湾曲	ファイン科学ツール	15023から10
トリトン-X100	ロート	3051.3
時計職人のforecepsデュモン5位	ロート	K342.1