自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピングその場でハイブリダイゼーション

Summary

超並列DNAシーケンシング技術に基づくゲノムアセンブリは、通常、非常に断片化されています。物理的な染色体マップの開発は、ゲノムアセンブリを改善する可能性があります。ここでは、染色体調製、蛍光in situハイブリダイゼーション、およびイメージングに対する革新的なアプローチを示し、物理マップ開発のスループットを大幅に向上させます。

Abstract

今後5年間で、脊椎動物10,000種¹と昆虫および節足動物²⁵⁰⁰種の全ゲノム配列を取得するプロジェクトが予定されています。例えば、15種のマラリア蚊のゲノムのシーケンシングは、現在、Illuminaプラットフォーム^3,4を用いて行われている。このハマダラカの種群には、マラリアの媒介生物と非媒介生物の両方が含まれています。ゲノムアセンブリが利用可能になると、研究者はベクター能力に関連する進化的変化を推測するための比較分析を行うユニークな機会を得ることができます。しかし、次世代シーケンシングリードを使用して高品質のde novoゲノムアセンブリを生成することは困難であることが証明されています⁵。さらに、ハマダラカの既存のゲノムアセンブリは、サンガー法を使用して取得されましたが、ギャップまたは断片化されています^4,6。

研究者が染色体ベースのゲノムアセンブリではなく、多数のシーケンシングコンティグを扱う場合、比較ゲノム解析の成功は限定的になります。断片化されたマッピングされていない配列は、次の理由でゲノム解析に問題を引き起こします:(i)未同定のギャップは、ゲノム配列の不正確または不完全なアノテーションを引き起こします。(ii)マッピングされていない配列は、パラロガス遺伝子と異なるハプロタイプ由来の遺伝子との間に混乱をもたらす。(iii)染色体の割り当てとシーケンシングコンティグの配向の欠如は、再配列の系統発生を再構築し、染色体の進化を研究することを可能にしません。新たに配列決定されたゲノムを持つ種の高解像度物理マップを開発することは、ゲノムアノテーション、進化解析、および自然集団からの個々のゲノムの再配列決定を容易にするタイムリーで費用対効果の高い投資です^7,8。

ここでは、染色体調製、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、および物理マップの迅速な開発を促進するイメージングへの革新的なアプローチを紹介します。An. gambiaeを例にとると、物理的な染色体マップの発達がゲノムアセンブリを改善し、ひいてはゲノム解析の質を向上させる可能性があることを示しています。まず、高圧法を用いてポリテン染色体スプレッドを作製します。この方法は、もともとショウジョウバエ⁹のために開発されたもので、通常のスカッシュ技術¹⁰よりも染色体の詳細を視覚化することができます。次に、FISH用の完全に自動化されたフロントエンドシステムが、ハイスループットの物理ゲノムマッピングに使用されます。自動スライド染色システムは、複数のアッセイを同時に実行し、ハンズオン時間を大幅に短縮します¹¹。第三に、電動スライドステージを含む自動蛍光イメージングシステムは、FISH¹²の後に標識された染色体を自動的にスキャンして撮影します。このシステムは、同じスライド上の複数の染色体プレートを同定し、可視化するのに特に有用です。さらに、スキャンプロセスにより、より均一なFISH結果がキャプチャされます。全体として、自動化されたハイスループットの物理マッピングプロトコルは、標準の手動プロトコルよりも効率的です。

Protocol

1. 卵巣看護師細胞からの高圧ポリテン染色体調製

1. 採血後25時間で半妊娠のハマダラカの雌を解剖顕微鏡で解剖し、メタノール(100%メタノール:氷酢酸、3:1)を含む新鮮な改変カルノイ溶液で卵巣を固定します。この段階では、卵巣はクリストファーズIIIの発達段階にあり、卵胞は楕円形をしており、卵胞内の看護師細胞がある透明な領域は丸い形をしています¹³。約5人の雌の卵巣を1.5 mLのエッペンドルフチューブに入れた500 μlの改変カーノイ溶液に入れ、室温で24時間保存します。卵巣を-20°Cに移して長期保存します。
2. スライドを作成する直前に、エタノール(100%エタノール:氷酢酸、3:1)と50%プロピオン酸で改変カルノイ溶液を調製します。1組の卵巣をほこりのないスライドに置き、改変したCarnoyの溶液を1滴入れます。.解剖針で卵巣を約6つのセクションに分割し、それらを50%プロピオン酸の滴下に置きます きれいなスライド MZ6ライカ実体顕微鏡下で。セクションごとに別々のスライドを使用します。
3. 針を使用して解剖する卵胞を分離し、解剖顕微鏡下で濾紙またはペーパータオルで残りの組織を拭き取ります。卵胞に50%プロピオン酸の新しい滴を加え、室温で3〜5分間放置します。50%プロピオン酸液滴の上にカバーガラスを置きます。スライドを約1分間放置します。
4. スライドを濾紙とプラスチックで包みます。フレックスシャフトアタッチメントと3000-5000RPMの間に設定された軟質プラスチックチップを備えたドレメル200回転工具を使用して、先端を円を描くように渦巻き、カバーガラスを軽く押して核を均等に広げることで卵胞を表現します。この手順には約 1 分かかります。オリンパスCX41位相顕微鏡で20倍対物レンズを使用して、広がりの品質を確認します。
5. 染色体を覆うカバースリップの隣に追加のカバースリップを配置してサンドイッチを準備し、2番目の顕微鏡スライドでそれらを覆います。これにより、万力でスライドが押しつぶされる可能性が低くなります。スライドをガラス製のスライド容器に入ったプラスチックシートと濾紙で包み、サンドイッチを保持し、万力によるスライドの引っかき傷から保護します。
6. メカニカルバイスを介してスライドに圧力をかけます。85-120インチポンドの圧力は十分であり、トルクレンチを使用して達成されます。このステップは、染色体をできるだけ平らにするために必要です。
7. 2枚目の顕微鏡スライドと追加のカバースリップを取り外します。染色体を覆うカバーガラスでスライドをスライド変性/ハイブリダイゼーションシステムで55°Cに10〜15分間加熱し、染色体をさらに平らにします。スライドを液体窒素に15秒以上浸し、バブリングが止まったら、カミソリの刃でカバースリップをすばやく取り外します。すぐにスライドを冷たい50%エタノールに5分間置きます。脱水液を70%、90%、100%のエタノールで各5分間スライドさせます。エアドライスライド。

2. 自動スライド染色システムを使用したFISH

プログラムは、Xmatrx自動スライド染色システムを使用して、プローブのラベリング以外の次の手順を実行するように設定されています。詳細なニックトランスレーションラベリングプロトコルは、FermentasのDNAポリメラーゼに付属のドキュメントに記載されています。

1. FISHの前に、ニックトランスレーションプロトコルを使用してゲノムBAC DNAを蛍光色素で標識することにより、蛍光プローブを調製します。1 μg の DNA、非標識 dATP、dCTP、および dGTP 各 0.05 mM と 0.015 mM dTTP、1 μl Cy3- または Cy5-dUTP、0.05 mg/ml BSA、5 μl の 10x ニックトランスレーションバッファー、20 ユニットの DNA ポリメラーゼ I、0.0012 ユニットの DNase I、およびヌクレアーゼフリー水 25 μl を混合します。DNAポリメラーゼI/DNase I比は、300〜500 bpのサイズ範囲のプローブを得るために経験的に選択されます。混合物を15°Cで1時間インキュベートします。
2. スライドと試薬をXmatrx自動スライド染色システムに入れ、プログラムを起動して次の手順を実行します。1x PBS800 μlを20分間アプライします。ブローは空気でスライドします。ホルマリン固定には、450 μLの4%ホルマリンを1x PBS溶液に1分間塗布し、その後、100%エタノールで1秒間2回、2分間1回洗浄します。ブローは空気でスライドします。
3. 45°Cで2分間熱スライドし、プローブを適用するときに泡立つのを防ぎます。DNAプローブ20μlを塗布し、ハイブリダイゼーション溶液の蒸発を避けるために鉱物油を一滴加え、その上にカバースリップを敷きます。スライドを90°Cで10分間加熱することにより、染色体とDNAプローブを変性させます。
4. ハイブリダイゼーションのために、カバースリップを装着した状態でスライドを42°Cで14時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション溶液は、2x SSC、100 mM リン酸ナトリウム、1x デンハルト溶液、100 μg/ml のアジ化ナトリウム、およびホルムアミド中の 10% デキストラン硫酸塩で構成されています。
5. ストリンジェンシー洗浄の場合は、スライドを42°Cで2分間加熱し、カバーガラスをはがし、スライドを2x SSCで1秒間4回洗浄します。ブローは空気でスライドします。0.4x SSC800 μlを42°Cで10分間、2回アプライします。スライドを2x SSCで25°Cで10分間洗浄します。
6. 染色体染色は、1x PBS中に1 μM YOYO-1 50 μlを塗布して行います。染色液が蒸発しないように鉱物油を一滴垂らし、カバースリップに貼り、25°Cで10分間インキュベートします。カバースリップをはがし、スライドを2x SSCで1秒間4回洗浄します。ブローは空気でスライドします。15 μlのProLong Gold退色防止試薬を塗布します。カバースリップを貼ります。

3. 蛍光自動イメージングシステムによるスライド読み取り

このセクションでは、ACCORD PLUS自動スキャンシステムに標準装備されているDuetソフトウェアの使用について詳しく説明します。電源を入れた後、ハロゲン電球用のオリンパスU-RFL-T電源、コンピューターのDell精密T3500、カメラが接続された顕微鏡オリンパスBX61オリンパスU-CMAD3の順に指示が始まります。

1. 10x Pre-Scanを設定するには、ACCORD PLUS自動スキャンシステムでDuetソフトウェアを開きます。「オンライン」ボタンをクリックします。新しいケースIDを入力し、スライドIDを割り当てます。「BF」と書かれたドットをクリックします。これは明視野オプションです。スキャンの選択肢を「10x Prescan」に設定します。「2500x circle」、「10000x circle」、「rectangle」を使用します。「Set&run」をクリックして、10x Pre-Scanを実行します。
2. 「OK」ボタンをクリックして、10x Pre-Scanを実行します。プロンプトに従って、スキャンを適切に調整します。「完了」をクリックしてスキャンを開始します。「メイン」タブを押してメイン画面に戻ります。「オフライン」ボタンをクリックします。割り当てられたケースIDとスライドIDを見つけて、「オフラインスキャン」をクリックします。左上の黒いボックスで矢印をクリックし、「10x Prescan」を選択します。矢印 (< || Δ > 別名「戻る」、「一時停止」、「再生」、「進む」ボタン) を使用して、スキャンした画像を確認します。
3. 目的の画像を見つけたら、ターゲット領域の中央にある画面をダブルクリックして、[スナップ]を押します。これにより、後でキャプチャする画像がターゲットになります。すべてのターゲットを選択したら、「分類」をクリックします。「10x Prescan」を選択します。画像を右クリックして、画像を分類する機会を得てください。「ポリテン」を選択します。
4. Duetソフトウェアで40倍プリスキャンを設定します。「メイン」をクリックしてメインメニューに戻ります。もう一度「オンライン」を選択します。スライドを選択します。「BF」を「FL」に変更します。タスク名を「Revisit-X40-RG」に変更します。最後の設定のすぐ下にあるセクションを「Revisit-ALL」に変更します。「Set&Run」をクリックします。「OK」を押します。プロンプトをもう一度実行して、自動化を設定します。「マッチングビューを開始」ボタンをクリックして、10x画像と40x画像を一致させます。「完了」をクリックしてスキャンを開始します。完了したら、「分類」をクリックして画像を見てください。

4. 代表的な結果

図1は、高圧染色体調製のスキームをグラフィカルに示しています。このステップには、Dremelツールとメカニカルバイスを使用した染色体の圧縮と平坦化のプロセス、および位相差顕微鏡を使用した染色体の可視化が含まれます。図2は、自動スライド染色システムを使用して染色体スライド調製物上のDNAを標的とする蛍光標識プローブのハイブリダイゼーション、FISH実験後のプローブの視覚化とマッピングのための自動走査顕微鏡の使用、および染色体上のゲノムスキャフォールドの配置と配向を示しています。

An. gambiaeの雌からの卵巣看護師細胞ポリテン染色体の調製は、高圧技術を使用して行われました。この方法では、染色体構造のほとんどを損傷したり変化させたりすることはありません(図3)。曲がった染色体を平らにするため、通常の調製物では見られない隠れた細かいバンドが明らかになります(図4)。

このプロトコルで使用されるプローブは、An. gambiae PEST株DNAから生成されたND-TAM BACライブラリーから得られたゲノムBAC DNAクローンです。このライブラリーのゲノムDNAは、新たに孵化した雌雄の初齢幼虫から抽出しました。図5は、AN. gambiaeのポリテン染色体にハイブリダイズしたBACクローンを使用したFISHの結果を示しています。この手順は、Xmatrx自動スライド染色システムを使用して行いました。An. gambiae¹⁰の細胞遺伝学的フォトマップを用いて、2つのBACクローン、102B24(GenBank:BH372701、BH372694)およびBAC 142O19(GenBank:BH368703、BH368698)を、それぞれ2Rアームのサブディビジョン16Cおよび16Dに局在させた。しかし、An. gambiae PEST株AgamP3アセンブリ¹⁴に対するBLAST探索により、2Rアームのサブディビジョン16Bおよび17Aでそれぞれ102B24および142O19と相同な配列が同定されました(表1)。したがって、ゲノム座標と細胞遺伝学的細分化との間の対応は、マッピングデータに従って調整できるようになりました。An. gambiaeのM型およびS型のゲノムアセンブリに対するBLAST検索により、2つのBACクローンは異なるコンティグに位置しているが、各フォーム内の同じ足場に位置していることがわかりました(表1)。同定されたコンティグは、特定の染色体位置に関連付けられるようになりました。さらに、同定された足場は、今や細胞学的細分化16CD内で適切に配向することができる。興味深いことに、足場の102B24配列と142O19配列の間の距離は、PEST株、M型、S型ゲノムアセンブリでそれぞれ1,892,981 bp、1,658,391 bp、および1,688,426 bpです。PEST株はM型とS型のハイブリッドであるため、この違いはPESTゲノムの誤ったアセンブリによるものと考えられます。

千株 千株 千株 千株 千株 の 千株 千株 千株 千株 の 千株 千株 千株 千株 千株 千株 千株 千株 千株

BAC (加盟)	PEST株 AgamP3 座標	M-フォーム contigs 座標	M-フォーム スキャフォールド 座標	Sフォーム contigs 座標	Sフォーム スキャフォールド 座標
102B24 (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874	ABKP020247 53.1 32,513- 33,045	EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909	ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832	EQ099711.1 215,891- 216,424
102B24 (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969	ABKP020247 51.1 24,816- 25,575	EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442	ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540	EQ099711.1, 305,514- 306,272
142O19 (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264	ABKP020247 01.1 2,499- 3,185	EQ090167.1 315,806- 316,492	ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942	EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325
142O19 (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323	ABKP020220 17.1 30,971- 32,469	EQ090167.1 200,518- 202,016	ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508	EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317

表 1. AN. gambiaeのゲノム集合体に対するBAC末端配列のBLAST結果。

図 1. 高圧染色体調製の概略図。蚊の卵巣は、発達の正しい段階で示されています。

図 2. 自動FISH、スライドスキャン、およびゲノムスキャフォールドの染色体マッピングを表すスキーム。

図 3. 高圧技術を使用して得られたAn.gambiaeのポリテン染色体3の広がり。3Lと3Rは、左右の腕のテロメアをマークします。PHとIHは、それぞれペリセントリックヘテロクロマチンとインターカラリーヘテロクロマチンを示します。

図 4. 従来の技術(上)と高圧(下)の技術を使用して調製されたAn.gambiaeポリテン染色体の比較。画像は、アーム3R(A)のサブディビジョン29A-30Eとアーム3L(B)の43D-46Dをカバーしています。

図 5. BACクローンの魚からAn.gambiaeのポリテン染色体へ。A) 102B24(赤色信号)と2Rアームのハイブリダイゼーション。B)102B24(赤信号)と142O19(青信号)のデュアルカラーFISHを、それぞれ伸ばした2Rアームのサブディビジョン16Cと16Dに。矢印は、Cy3(赤)とCy5(青)で標識されたBACクローンのハイブリダイゼーションのシグナルを示しています。C-セントロメア領域。a/+はヘテロ接合体2Laの反転を示しています。染色体は、蛍光色素YOYO-1で対比染色しました。

Discussion

高圧処置の最も重要なステップは、卵巣発育のクリストファーズIII段階で単離された卵巣看護細胞を適切に押しつぶすことです¹³。不適切な押しつぶしは染色体の不十分な広がりにつながる可能性があり、FISH後にプローブの位置を特定しようとするときに問題を引き起こす可能性があります。染色体が過度に押しつぶされると、縞模様が失われるほど染色体が壊れたり伸びたりする可能性があります。複数のスライドを作成すると、Dremel ツールを使用してスライドを押しつぶそうとするときに一貫性が得られ、スライド全体の生産効率が向上します。高圧技術は、新たに分離された唾液腺用に最初に開発されました D. melanogaster⁹。しかし、蚊の卵巣は、染色体調製に使用される前に、修飾カルノイ固定液(3メタノール:1体積の氷酢酸)で日常的に保存されます。そこで、既存の高圧プロトコルを修正して、マラリア蚊の固定卵巣看護師細胞ポリテン染色体に適したものにしました ガン ビア。スライド全体の作業面が非常に平行な精密万力を使用して高圧が加えられるため、鉛筆の消しゴムを使用した従来のタッピング技術を使用するよりも、染色体カボチャの準備にかかる時間が大幅に短縮されます。

その他の重要な手順には、卵胞を50%プロピオン酸に十分に浸し、スライドを加熱することが含まれます。これらのステップは両方とも、染色体を平らにするために不可欠です。これらを無視すると、脱水後に染色体が光沢を持って見える可能性があり、FISHのシグナルと間違われる可能性のある過剰なバックグラウンドにつながる可能性があります。高圧押しつぶし技術は、有糸分裂染色体調製を行うときに同じ溶液を使用してもうまく機能します。追加の広がりと平坦化は、核から染色体をよりよく発現するのに役立ちます。均等な圧力を加えると、それに応じてそれらを平らにして、測定が可能になり、染色から見えるバンドの解像度が向上する可能性があります。蚊から有糸分裂染色体を単離する方法の詳細は、他の場所で示されています¹⁵。通常のスカッシュ製剤は、FISH ¹⁶ や免疫染色¹⁷などの多くの目的に十分ですが、高圧法は、あるスライドから次のスライドへの潜在的な分散を低減するだけでなく、染色体全体の質を向上させ、染色体をマッピングする際の詳細につながります。この手順は、レーザーキャプチャマイクロダイセクション用のポリテン染色体膜スライドの調製にも使用できます。

高圧法の制限には、スライドの破損と染色体の過度の伸張が含まれます。万力を介してスライドに過度のストレスをかけることによるスライドの破損は可能ですが、記事に示されている圧力を使用することで制限されます。染色体の過度の伸びについては、ドレメルツールをスライドに長時間適用すると、染色体が伸びすぎて解像度が低下する可能性があります。これは、染色体が十分に広がっていない場合は、ツールを短時間適用し、顕微鏡下で確認し、ドレメルツールでさらに時間を適用することで改善できます。

従来のFISHプロトコルには、通常5〜20分の長さの洗浄およびインキュベーションステップが多数含まれており、実験の全期間にわたって研究者のほぼ完全な注意が必要です。さらに、手動で処理できるスライドの数は、通常、特定の実験で数枚のスライドに制限されます。対照的に、自動スライド染色システムは、すべてのステップ(洗浄、インキュベーション、プローブ塗布、変性、ハイブリダイゼーション、カバーガラス塗布、除去を含む)を自動的に実行します。これにより、FISH実験の研究者は最大6〜8時間の労働時間を解放できます。さらに、自動化されたFISHシステムは、スループットを大幅に向上させることができます。たとえば、Xmatrxシステムは、単一の調製スライドで最大40のアッセイを、デュアル調製スライドで最大80のアッセイを同時に処理できます。このシステムの限界は、大量の溶液を調製する必要があるため、少数のFISH実験では効率的ではないことです。さらに、システムにプログラムされたFISHプロトコルは、新しいアプリケーションのために変更や調整が必要になる場合があります。

スライドスキャンシステムは、蛍光顕微鏡の自動化バージョンです。自動ステージ移動とシンプルな顕微鏡コントロールパネルにより、研究者の時間が解放され、顕微鏡の操作が非常に簡単になります。たとえば、ACCORD PLUSスキャンシステムのソフトウェアを使用すると、複数の蛍光チャンネルを簡単にキャプチャし、画像取得を簡単に管理できます。この例は、単一の画像を撮影するのではなく、zスタックキャプチャを含めることです。ソフトウェアは、構成可能な画像のZスタックをキャプチャして、少なくとも1つの画像に焦点が合っていることを確認します。このシステムは、複数の画像取得(1枚のスライドに多くの細胞)用に作られていますが、スライドを手動で移動するよりもスライド上の染色体を見つけるのがはるかに簡単になります。

自動スライド染色システムとスキャンシステムはどちらも、細胞遺伝学クリニックによるヒト細胞の染色体異常のFISH診断に日常的に使用されています。本研究では、これらの自動化システムを基礎研究用途に活用するプロトコルを開発しました。自動化されたハイスループット物理マッピングプロトコルは、関心のあるあらゆる種の物理染色体マップの迅速な開発を容易にします。このレポートでは、物理的なマッピングにポリテン染色体を使用しましたが、有糸分裂染色体もこれらのシステムで利用できます。大多数の生物は読み取り可能なポリテン染色体を発達させないため、プロトコルを有糸分裂染色体に調整することは有用です。ただし、ポリテン染色体が利用可能であれば、機能的ゲノムドメインと染色体構造との対応に関する有用な情報を最高解像度で提供できます。バンドやバンド間のパターンなどのポリテン染色体の組織原理は、最近、通常の非ポリテン(間期)染色体の組織原理に例えられています¹⁸。したがって、高圧染色体調製物に対して実行される詳細な物理的マッピングは、DNA配列をバンド、インターバンド、パフ、セントロメア、テロメア、ヘテロクロマチンなどの特定の染色体構造にリンクする可能性があります。したがって、染色体ベースのゲノムアセンブリを作成します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
22x22 mm顕微鏡カバースリップ	フィ	ッシャー12-544-10
18x18 mm顕微鏡カバースリップ	フィ	ッシャー12-553-402
酢酸	フィ	ッシャーA491-212
メタノール	フィ	ッシャーA412-4
ピオン酸	シグマアルドリッチ	402907
ドレメル200フレックスシャフト付き回転工具			3インチ多目的ミニベンチグラインダー(レートリミッター付き)
特別に設計された200 μl ドレメル工具用プラスチックチップ(ビーズプラスチックエッジ)	ピペットマン	F171300	ピペットチップの脂肪端をカットして加熱
錫コーティングラピッドバイス	アベンジャーゴールド工具メーカー	MTC-200-1	精密研削正方形および0.00025以内に平行
トルクレンチ	職人	44593
ThermoBrite スライド 変性/ハイブリダイゼーションシステム	アボット モレキュラー	30-144110
25 mm バリアスライド	アボット モレキュラー	XT108-SL
25 mm カバースリップ	アボット モレキュラー	XT122-90X
Xmatrx 自動スライド染色システム	アボット モレキュラー	08L46-001
MZ6 ライカ実体顕微鏡	ライカ	VA-OM-E194-354	別の実体顕微鏡を使用できます
オリンパス CX41 フェーズ顕微鏡	オリンパス	CX41RF-5	相の顕微鏡を使用できます
ACCORD PLUS 自動スキャンシステム	BioView (米国)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (中性緩衝ホルマリン)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% ホルムアミド	フィッシャーサイエンティフィック	BP227500
デキストラン硫酸ナトリウム塩	Sigma	D8906
20x SSC バッファー	Invitrogen	AM9765
リン酸ナトリウム	Sigma-Aldrich	S3264
50x デンハルト溶液	Sigma-Aldrich	D2532
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002
DMSO 中の 1 mM YOYO-1 ヨウ化物 (491/509) 溶液	Invitrogen	Y3601
ProLong Gold 退色防止試薬	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA ポリメラーゼ I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521