機能や中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発中の遺伝子の調節を評価するために、我々は、関与の方法について説明します。エレクトロポレーション。この手法は、脳の発達とドーパミン作動性ニューロンへの分化のさまざまな側面を研究する目的遺伝子の効率的な発現を達成するために使用することができます。
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方法論記事
ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
腹側中脳のコントロールの動きにありますドーパミン作動性ニューロン、感情的な動作、および報酬のメカニズム1-3。腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンの機能不全は、パーキンソン病、統合失調症、うつ病、認知症1-5に関与している。したがって、中脳ドーパミン作動性ニューロンの分化の調節を研究することだけ脳の開発と神経前駆細胞の運命仕様を制御するメカニズムに重要な洞察を提供することができませんでしたが、また人間の神経疾患の様々を治療するための新たな治療戦略の開発に役立つ。
ドーパミン作動性ニューロンは、胚腹側中脳の脳室帯の内側を覆う神経前駆細胞から分化する。神経前駆細胞の開発は、6,7の遺伝子発現プログラムによって制御されます。ここでは、（目のハンバーガーハミルトン（HH）ステージ11の脳に特異的に遺伝子を発現するエレクトロポレーションを利用する技術を報告するirteen体節、42時間）ニワトリ胚8,9。ニワトリ胚の外部の開発は、後の発達時点10月13日で決定の影響で、特定胚の段階で便利な実験操作が可能になります。以前のHHステージ13（19体節、48時間）以上のニワトリ胚神経管、神経系の異なる細胞型に分化することができる多能性神経前駆細胞で構成されています。 CMVプロモーターおよびニワトリβ-アクチンエンハンサーの両方が含まれていますpCAGベクトルは、旗やニワトリ胚神経管14内の他のエピトープタグ付き構造体の強い発現が可能になります。本稿では、DNAは胚の中脳領域に特異的に構築し、どのように小さなカスタムメイドの電極をエレクトロポレーションを特定するために注入する方法など、胚の中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に地域制限の遺伝子発現を達成するための特別措置を強調しています。 Cの分析後の段階で田舎者の脳は、脳開発のプラスミドベクターによるゲインの関数と機能喪失研究のための生体システムに優れた提供しています。実験システムの変更が運命マッピング解析を実行するために、遺伝子発現の調節を調べるための神経系の他の部分に分析を拡張することができます。
プロトコル
1。電源の準備（ないビデオ）
- 1X PBSでペニシリン/ストレプトマイシン（ペン/連鎖球菌）の新鮮な1X希釈を準備します。以上50 mLのが必要です。 0.22μmのシリンジフィルターでろ過する。
- 所望のプラスミドコンストラクトを組み合わせることにより、注入構造を準備します。我々は〜10μLの最後のボリュームに適切な化学量論でpCAG-フラグベクトル内のすべての構成要素を入れた。また、pCAG-GFP 14またはpCAG-mCherryは、トラッキングエレクトロポレーションの効率化とエレクトロポレーションした細胞を追加する必要があります。我々はこの実験のためにpCAG-mCherryを使用しています。最後に、ニワトリ胚midbrainsに注入効率を視覚化するために0.05％の最終濃度でプラスミドDNAの混合物に0.22μmのろ過ファストグリーン染料を追加します。
2。卵の準備（ビデオで）
- 11胚を取得HHステージにするために、卵は25から40パーセントの湿度と受精後約41時間°F（37.8℃）100℃でインキュベートする必要があります。場所彼らの側に卵と鉛筆ダッシュそれぞれのトップをマークします。予め温めておいた、加湿インキュベーター中トレイを置きます。ゆっくりにインキュベータープラットフォームの回転機能を設定することによって、卵を揺する "自動"湿度と水のレベルを24時間ごと....
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ディスカッション
ニワトリ胚中脳の卵エレクトロポレーションで中脳ドーパミン作動性ニューロンの開発に遺伝子機能のin vivo試験で実行するトランスジェニックやノックアウト動物の世代に、低コストかつ迅速な代替手段を提供しています。胚の中脳特異的DNAインジェクションと一緒に短い2ミリメートル長いL字型の白金電極を使用すると、中脳ドーパミン作動性ニューロン前駆細胞に目的遺伝子の効率的な発現を達成するための鍵となります。さらに、正しいHHステージ11ニワトリ胚を使用することが重要です。最初に、HHステージ11で、ニワトリの脳の開発が十分に前脳、中脳、後脳とは形態的に区別するように進んでいるためです。これは、中脳領域での注射針と電極の正確な位置決め、したがって、効率的なDNAインジェクションとトランスフェクションが可能になります。第二に、HHステージ11で、ニワトリ胚の前神経孔は、まだ完全に閉じません。D、注入されたプラスミドDNAは容易に脳領域に特異的に入力することができます。胚の前脳、中脳と後脳の間の狭い接合部は、DNAの高速拡散を防ぐことが脳に特異的に注入されたコンストラクト。最後に、.......
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開示事項
著者らは、開示する潜在的な利害を持っていません。
謝辞
我々はpCAG-mCherryが構築提供するために博士隆彦松田に感謝します。 YCMはSchweppe財団からのキャリア開発賞とホワイトホール財団からの助成金によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 受精鶏卵 | チャールス·リバー | ||
| 卵インキュベーター | GQF製造 | 1502スポーツマン | |
| BTXエレクトロ | BTXハーバード装置 | ECM830 | |
| 電極 | BTXハーバード装置 | 45から0162 L字型genetrodes | ECM830エレクトロで使用するために |
| プラチナイリジウム線 | アルファAesar社 | ＃10056 | 直径0.5mm 2ミリメートル長さの電極を作るため |
| ガラス毛細管 | 世界の精密機器 | TW100F-4 | |
| Microloaderピペットチップ | エッペンドルフ | 5242 956.003 | |
| 墨 | ステープルズ | 使用前に20％をフィルタリングする | |
| 微量注入器 | パーカーオートメーション、 パーカー·ハネフィンの協力 | Picospritzer III | |
| 蛍光解剖顕微鏡 | ライカ | MZ16F | |
| マイクロピペットプラー | サッターインストゥルメント | D-97 |
参考文献
- Wightman, R. M., Robinson, D. L. Transient changes in mesolimbic dopamine and their association with 'reward'. J. Neurochem. 82, 721-735 (2002).
- Kelley, A. E., Berridge, K. C. The neuroscience of natural rewards: relevance to addictive drugs. J. Neurosci.
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再版と許可
