我々は、抗原特異的ラットTリンパ球のラインのin vitroでの拡大のために使用されるT細胞増殖因子の調製を記載。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
培養中の抗原特異的T細胞株やクローンのメンテナンスは、細胞の膨張の1,2の段階で区切られた抗原誘発活性化のラウンドが必要です。拡張フェーズ中に培地にインターロイキン2の添加は細胞死を防止するために必要と短期的なT細胞株を維持するのに十分ですが、Th1の偏光3を高めることが示されている。サイトカインの組み合わせを含むT細胞増殖因子（TCGF）によるインターロイキン2の交換は、in vitro 3に、長期的なT細胞株を維持するためにインターロイキン2よりも効果的です。また、TCGFは、簡単に実験室で大量に用意し、組換えインターロイキン2よりもはるかに安価であることができる。
ここで、我々はラット脾細胞培養上清からTCGFを準備する方法を示します。この手順では、我々は胸腺と血液採取のために安楽死させナイーブLewisラットから脾臓を採取する。我々は、脾臓からの単細胞懸濁液を準備し、浸透圧ショックにより赤血球をlyze、およびシード培地に脾細胞。細胞は、コンカナバリンA、非選択的にサイトカインの産生を誘導する、すべてのラットのTリンパ球を活性化することをマイトジェンで刺激されています。文化supernantantがandexcessコンカナバリン48時間後に収集されるTCGFが追加されるT細胞株を活性化するからそれを防ぐために、アルファメチルマンノシドにバインドされています。 TCGFは、分注し、滅菌濾過し、-20℃で保存
プロトコル
- ルイスラットの脾臓（160〜200グラムの間でラット最高のものを）取る。セルストレーナーを使用してPBS +抗生物質（PBS - PS）を含むペトリ皿に氷の上で引き裂く。 50 mlチューブに入れ。 PBS - PSで埋める。
- 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
- 細胞を2回洗浄する。
- NH 4 Clを 0.15 M（脾臓あたり5 ml）溶液でペレットを再懸濁します。赤血球を溶解するために氷上で3分間ピペットで静かにかつ継続的に混ぜる。培地でチューブを埋める。
- 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
- 細胞を2回洗浄する。
- 細胞を数える。ラットの脾臓は、200〜250000000細胞を与えます。
- シード完全培地のMLに200万のセル：75 cm 2のフラスコに50 mlです。
- インキュベーターで48時間に成長しましょう。
- 細胞をペレット化するために4℃で15分間Cを回転させる。
- 上清を収集し、セルを廃棄。
- 上清に15 mg / mlのメチルマンノシドを追加。充分に混合する。
- フィルター（0.2 mm）の
- -20℃で分注しストア必要に応じて10日間4℃に保つことができる。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
我々は定期的に血清とthymusの複数形は、in vitroでルイスラットT細胞株を刺激するために収穫するために、この株からナイーブなラットを安楽死させるので、我々は、ルイスラットの脾細胞からTCGFを準備。このTCGFは、他のラット系統からのT細胞系の増殖と生存を促進するために使用することができます。 TCGFは、ラットの他の株から調製することができる。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者に開示すべき事項はありません。
材料
完全培地を準備するにはRPMI 1640と滅菌フィルターの500mlボトルに以下を追加します：10％FCS、PSGのボトル1本、5ミリリットルRPMIのビタミン、5 mlのピルビン酸ナトリウム、5ミリリットル非必須アミノ酸、50μMのβ-メルカプトエタノール、2 ug / mlとコンカナバリンAの
参考文献
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
