ラットの脾細胞からT細胞増殖因子の準備

サマリー

我々は、抗原特異的ラットTリンパ球のラインのin vitroでの拡大のために使用されるT細胞増殖因子の調製を記載。

要約

培養中の抗原特異的T細胞株やクローンのメンテナンスは、細胞の膨張の^1,2の段階で区切られた抗原誘発活性化のラウンドが必要です。拡張フェーズ中に培地にインターロイキン2の添加は細胞死を防止するために必要と短期的なT細胞株を維持するのに十分ですが、Th1の偏光^3を高めることが示されている。サイトカインの組み合わせを含むT細胞増殖因子（TCGF）によるインターロイキン2の交換は、in vitro ³に、長期的なT細胞株を維持するためにインターロイキン2よりも効果的です。また、TCGFは、簡単に実験室で大量に用意し、組換えインターロイキン2よりもはるかに安価であることができる。

ここで、我々はラット脾細胞培養上清からTCGFを準備する方法を示します。この手順では、我々は胸腺と血液採取のために安楽死させナイーブLewisラットから脾臓を採取する。我々は、脾臓からの単細胞懸濁液を準備し、浸透圧ショックにより赤血球をlyze、およびシード培地に脾細胞。細胞は、コンカナバリンA、非選択的にサイトカインの産生を誘導する、すべてのラットのTリンパ球を活性化することをマイトジェンで刺激されています。文化supernantantがandexcessコンカナバリン48時間後に収集されるTCGFが追加されるT細胞株を活性化するからそれを防ぐために、アルファメチルマンノシドにバインドされています。 TCGFは、分注し、滅菌濾過し、-20℃で保存

プロトコル

1. ルイスラットの脾臓（160〜200グラムの間でラット最高のものを）取る。セルストレーナーを使用してPBS +抗生物質（PBS - PS）を含むペトリ皿に氷の上で引き裂く。 50 mlチューブに入れ。 PBS - PSで埋める。
2. 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
3. 細胞を2回洗浄する。
4. NH _{4 Clを} 0.15 M（脾臓あたり5 ml）溶液でペレットを再懸濁します。赤血球を溶解するために氷上で3分間ピペットで静かにかつ継続的に混ぜる。培地でチューブを埋める。
5. 4℃で10分間スピン° Cの細胞をペレット化する。
6. 細胞を2回洗浄する。
7. 細胞を数える。ラットの脾臓は、200〜250000000細胞を与えます。
8. シード完全培地のMLに200万のセル：75 cm ^2のフラスコに50 mlです。
9. インキュベーターで48時間に成長しましょう​​。
10. 細胞をペレット化するために4℃で15分間Cを回転させる。
11. 上清を収集し、セルを廃棄。
12. 上清に15 mg / mlのメチルマンノシドを追加。充分に混合する。
13. フィルター（0.2 mm）の
14. -20℃で分注しストア必要に応じて10日間4℃に保つことができる。

ディスカッション

我々は定期的に血清とthymusの複数形は、in vitroでルイスラットT細胞株を刺激するために収穫するために、この株からナイーブなラットを安楽死させるので、我々は、ルイスラットの脾細胞からTCGFを準備。このTCGFは、他のラット系統からのT細胞系の増殖と生存を促進するために使用することができます。 TCGFは、ラットの他の株から調製することができる。

材料