このビデオでは、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）と免疫組織化学（IHC）を用いたヒト膵島の特性評価のための手順を示しています。頭、体、尾領域から膵臓のセクションは膵島内分泌物（インスリン、グルカゴン、膵臓ポリペプチド）、細胞複製（Ki67）、および炎症性浸潤（H＆E、CD3）を決定するためにH＆EとIHCの両方で染色されています。鉤状領域は、膵ポリペプチドに対してIHCを使用してローカライズされています。
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この記事について
サマリー
要約
膵島面積と数字および成人ヒト膵臓の内分泌細胞組成の推定値は数十万から500〜1500 mgの1-3に数百万とベータの質量範囲に異なります。この既知の不均一性と、標準処理と染色手順は、膵臓領域を明確に定義されており、島には厳格な組織病理学および免疫学的局在診断を用いて特徴づけたように開発されました。
臓器提供者から回収されたヒト膵臓を処理するための標準的な手順は、このシリーズのパート1で説明されています。膵臓は、横断に続いて3つの主要領域（頭、体、尾）に処理されます。膵臓の頭部からの横断は、サイズに基づいて示されているように、さらに分割し、サブセクションを示すためにアルファベット順に番号が付けられています。この標準化は、構成の小島が含まれている鉤状領域を含む頭部の完全な断面分析を可能にする主に尾部領域、膵ポリペプチドの細胞。
現在のレポートには、このシリーズのパート2を含み、シリアルセクショニングと膵島内分泌細胞、レプリケーション、およびT細胞の浸潤に重点を置いた膵のパラフィン切片の病理組織学的特性評価に使用する手順について説明します。膵臓切片の病理は、外分泌、ductular、内分泌の両方のコンポーネントを特徴づけることを意図しています。外分泌コンパートメントは、特に膵臓の膵管内腫瘍4の存在との関係では、膵炎（アクティブまたは慢性）、萎縮、線維症、脂肪の存在だけでなく、ダクトシステムに評価されます。膵島の形態、大きさ、密度、内分泌細胞、炎症、線維症、アミロイド、およびH＆EとIHC染色を使用して複製またはアポトーシス細胞の有無を評価されます。
パート2で説明した最後のコンポーネントは、染色されたスライドの提供です。デジタル化されたスライド全体のイメージとしての。デジタル化されたスライドは、仮想バイオバンクを作成するオンライン病理データベースの場合、膵臓領域によって構成されています。このオンラインコレクションへのアクセスは現在、1型糖尿病の研究に関与して200以上の臨床医と科学者に提供されています。オンラインデータベースは、迅速かつ完全なデータ共有のために、パラフィンまたは凍結連続切片のブロックを選択するための捜査手段を提供します。
プロトコル
1。染色切片用ミクロトーム
- 標準的なパラフィンミクロトーム用として、水浴及びミクロトームを設定します。ケース番号、膵臓領域（サンプル）およびスライド番号を使用して正に荷電したスライドと事前にラベルを使用しています。左側にカセットのラベルを持つミクロトームチャックに配置し、パラフィンブロック。
- 組織が均一に検出されるまでブロックに通常のミクロトームの手順は、セクションに従ってください。連続切片（厚さ4μmの、初期の必要な汚れの数に応じて3-6（ケース提出フォームは、 付録1を参照））のリボンを生成します。リボン内の別のセクションでは、順番にそれぞれをピックアップし、鉛筆で番号順でスライド上の場所。セクションでは、正確な順序でセクション番号を付け、未使用である場合示す。左に向き、スライドラベル付きカセットに見られるように、スライド上の同じ方向を維持します。その後の研究に染色またはディストリビューションに進み、室温で一晩乾燥させます。
- 解像度室温または-20℃で組織し、アーカイブを維持するためにパラフィンの薄い層を有するパラフィンブロックのEAL表面
- その後のミクロトームの場合は、上記のように各レベルで連続切片の番号を維持。 1つの追加のスライドを取得し、各ブロック内の各〜100μMレベルのH＆E染色スライドで。
2。 H＆E染色
- autost....
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ディスカッション
IHC手順の標準化は、時間をかけてスライドの多数を越えて、コンピュータベースのアルゴリズムを使用する場合は特に、画像解析のために重要です。このレポートに記載されIHC染色の手順は、8時間の作業日以内にautostainerを使用して、特定のドナーのサンプルのバッチ分析をできるようになり、以前の報告書5から変更されます。各染色されたスライドのデジタル化されたスライド全体のイメージは、Webベースのオンライン病理システムを介してnPOD系の研究者に利用できるようになります。調べでは、（参照スライドと一緒にドナーの人口統計、実験データ、および他の適切な病歴を確認し、彼らの研究に最も適したブロックを選択することができますすることができますhttp://www.jdrfnpod.org/online-pathology.php詳細については、）を。このようなオンラインの病理システムは、 "仮想バイオバンク"としての役割を果たします。このシステムへの更なる改.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
著者らは、ドナーの家族や専門家の支援のため、本研究とエミリー·モンゴメリー、ロバートPietras、アンフー、Mitali Agarwalさんと、ロシャンAgarwalさんに関与する臓器調達機関に感謝します。この作品は、糖尿病患者の膵臓の臓器提供者のネットワークをサポートするために青少年糖尿病研究財団（MC-T.）によって資金を供給された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| 30％過酸化水素（H 2 O 2） | FisherScientific | H325-500 | 内因性ペルオキシダーゼのブロッキング |
| ABC-アルカリホスファターゼ（AP） | ベクトル | AK-5000 | APコンジュゲート |
| 抗体希釈液 | インビトロジェン | 003218 | 一次抗体 |
| アビジンブロッカー | ベクトル | SP-2001 | 内因性ビオチンをブロックする |
| ビオチン化ヤギ抗モルモット | ベクトル | BA-7000 | 二次抗体 |
| ブルーイング試薬 | FisherScientific | 7301 | ライカautostaineR |
| クエン酸緩衝液、pH6.0 | BioGenex | HK086-9K | 抗原回復 |
| 清澄1 | FisherScientific | 7401 | ライカautostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312から4 | カバーガラス封入 |
| DAB | ベクトル | SK-4100 | HRP発色 |
| DEEB | DAKO | S2003 | ブロッキング試薬内因性AP |
| アルコールエオシンY | FisherScientific | 71204 | ライカautostainer |
| Ethanols-100％、95％、90％、70％ | FisherScientific | さまざまな | 脱パラフィンと封入 |
| ヘマトキシリン | DAKO | S3301 | Dako社autostainer |
| ヘマトキシリン7211 | FisherScientific | 7211 | ライカautostainer |
| IgG抗体（一次抗体のすべてのホスト種） | さまざまな | さまざまな | 予備選挙のためのネガティブコントロール |
| 液体パーマネントレッド（LPR） | DAKO | K0640 | AP発色 |
| MACH2 AP | バイオケア·医療 | MALP521L | ヤギ抗マウスAPコンジュゲート |
| MACH2 HRP | バイオケア·医療 | MHRP520L | ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート |
| MACH2 HRP | バイオケア·医療 | RHRP520L | ヤギ抗マウスHRPコンジュゲート |
| メタノール | FisherScientific | さまざまな | H 2 O 2希釈剤 |
| 正常ヤギ血清 | ベクトル | S-1000 | IHCブロッキング試薬 |
| スナイパー | バイオケア·医療 | BS966M | IHCブロッキング試薬 |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHCバッファー |
| Triology 20倍 | セルのマーケ | 920P-06 | 抗原回復 |
| キシレン | FisherScientific | さまざまな | 脱パラフィンと封入 |
表1特定の試薬 が含まれています。
| 一次抗体 | 宿主動物種 | ベンダー | 猫。 ＃ | コメントと抗原検索 |
|---|---|---|---|---|
| パラフィン | ||||
| アミラーゼ | マウス | サンタクルス | SC-46657 | クエン酸塩 |
| アミリン | マウス | Serotec | MCA11267 | クエン酸塩 |
| 炭酸脱水酵素19.9 | マウス | アブカム | ab15146 | |
| 切断されたカスパーゼ-3、 | ウサギ | 細胞シグナリング | 9961 | クエン酸またはトリロジー |
| CD20 | マウス | DAKO | M0755 | クエン酸またはトリロジー |
| CD3 | ウサギ | DAKO | A0452 | クエン酸塩 |
| CD34 | マウス | 細胞シグナリング | 3569 | クエン酸塩 |
| CD4 | マウス | DAKO | M7310 | クエン酸塩 |
| CD45 | マウス | DAKO | M0754 | クエン酸塩 |
| CD68 | マウス | DAKO | M0876 | クエン酸塩 |
| CD8 | マウス | DAKO | M7103 | クエン酸塩 |
| クロモグラニンA | ウサギ | DAKO | A0430 | クエン酸塩 |
| CK17 | マウス | DAKO | M7046 | クエン酸塩 |
| CK19 | マウス | DAKO | M0772 | クエン酸塩 |
| CK7 | マウス | DAKO | M7018 | クエン酸塩 |
| C-ペプチド | ウサギ | 細胞シグナリング | 4593 | クエン酸塩 |
| Foxp3は | ラット | 電子バイオサイエンス | 14-4776-80 | クエン酸塩 |
| グレリン | ヤギ | サンタクルス | SC-10386 | |
| グレリン | ウサギ | アブカム | ab85104 | |
| グルカゴン | ウサギ | DAKO | A0565 | |
| グルカゴン | マウス | アブカム | ab10988 | クエン酸塩 |
| グルカゴン | モルモット | Bachem | T-5037 | クエン酸塩 |
| Glut-1の | マウス | アブカム | ab40084 | 3部作 |
| GLUT-2 | ウサギ | サンタクルス | SC-9117 | ヒト膵島で発現していない |
| インスリン | モルモット | DAKO | A0564 | |
| Ki-67の | マウス | DAKO | M7240 | クエン酸塩 |
| MAFA | ウサギ | ノーバス生物 | NB400-137A | 3部作 |
| 膵臓ポリペプチド | ウサギ | インビトロジェン | 18から0043 | クエン酸塩 |
| PDX-1 | モルモット | アブカム | ab47308 | クエン酸またはトリロジー |
| プロインスリン | マウス | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| プロインスリン | マウス | 発達研究ハイブリドーマバンク | GS-9A8 | クエン酸塩 |
| Secretagogin | ウサギ | シグマ | HPA 006641 | クエン酸塩 |
| 平滑筋アクチン | ウサギ | アブカム | ab5694 | |
| ソマトスタチン | ウサギ | DAKO | A0566 | |
| シナプトフィジン | マウス | DAKO | M0776 | クエン酸塩 |
| 冷凍新鮮な | 宿主動物種 | ベンダー | 猫。 ＃ | コメント |
| CD11bを | ラット | アブカム | ab6332 | 4％のPFと修正 |
| CD11cは | ウサギ | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | マウス | ノーバス生物 | NB 600から564 | パラフィン切片のために一晩インキュベーションを使用して、 |
| CD94 | マウス | アブカム | ab61874 | アセトンで固定する |
| GAD65 | マウス | サンタクルス | SC-130569 | 4％のPFと修正 |
| HLA-ABC | マウス | DAKO | M0736 | アセトンまたは4％PFと修正 |
表2一次抗体。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アペリオScanscope CS | アペリオ | デジタルスライドスキャナ | |
| DAKO Autostainerプラス | DAKO | IHC染色 | |
| ラベル行列印刷ソフトウェア | BioCarta | LM7UP57 | スライドラベルソフトウェア |
| ライカXL Autostainer | ライカ | H＆E染色 | |
| プレミアムカバーガラス | FisherScientific | 12から548-5J | カバースリップ |
| スペクトル情報マネージャ | アペリオ | スキャナソフトウェア | |
| Superfrostプラススライド | FisherScientific | 12-550-15 | 正に荷電したスライド |
| 野菜蒸し器 | ブラック＆デッカー | さまざまな | 抗原回復 |
| ゼブラTLP 3742 | CDWG | TLP3742 | スライドラベルプリンタ |
表3固有の供給と装置。
参考文献
- In't Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008). ....
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