神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に in vitroで移行、自己再生し、神経堤の多能性を研究するための方法。
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この記事について
サマリー
要約
胚の神経堤（NC）は、神経管の背側面に由来する多能性前駆細胞集団である間葉移行（EMT）に上皮を受け、多様な細胞の種類1-3に上昇を与えて、胚全体に移行します。 NCはまた、標的器官4-6の分化と成熟に影響を与えるユニークな能力を持っています。 in vitroで外植する場合は、NC前駆細胞が自己再生を受けて、移行し、神経細胞、グリア細胞、平滑筋細胞、軟骨および骨を含む組織、さまざまな種類の細胞に分化する。
NCの多能性は、最初の鳥の神経管7-9の外植片から記述されていた。NC細胞の in vitro での分離では増殖、移行、および多能含むNCダイナミクスの研究を容易にします。胚10に戻って移植時に植NC細胞は、そのNCの可能性を保持することを明らかに鳥とネズミシステムの更なる作業-13。これらの固有の細胞の特性が植NC前駆細胞に保持されているため、神経管植アッセイは、in vitroでの NCを研究するための魅力的なオプションを提供しています。
哺乳類のNCのより良い理解を達成するために、多くのメソッドは、NC集団を分離するために採用されています。 NC-由来の前駆細胞がポスト渡り鳥NC前駆11,14-20のダイナミクスを研究するための胚と成人の両方で、ポスト渡り鳥の場所から培養することができる、しかし、彼らは神経管からの移住としてNC前駆細胞の分離は、最適な保全を提供していますNCの潜在的な細胞や渡り鳥プロパティ13,21,22。いくつかのプロトコルは、特定の前駆細胞11,13,14,17を濃縮NC人口を分離するために蛍光活性化細胞選別（FACS）を採用しています。しかし、初期段階の胚から始まるときは、分析のための十分な細胞数は初期のNC populatioの分離を複雑にし、FACSを得ることが困難である個々の胚からNS。ここでは、Wnt1-Creリコンビナーゼ活性化系レポーター23に基づいて約96％純粋なNC集団のFACS、その結果に依存しないアプローチを説明します。
ここで紹介する方法は、ラットNC 11,13の培養に最適化されたプロトコルから構成されている。このプロトコルは、従来の方法に比べての利点は、1）細胞はFACS））は、比較的純粋なNCの人口、3を取得する必要はありませんpremigratory NC細胞が分離されている、4）フィーダー層2上に成長されていない結果が簡単にあることです。定量化した。さらに、このプロトコルは、異なる遺伝的操作とNC特性の研究を促進し、任意の変異マウスモデルからNCの分離に使用することができます。このアプローチの制限は、NCはNC 2,24-28の生存、遊走、分化に影響を及ぼすことが知られている胚のコンテキストから削除されていることです。
プロトコル
1。プレートの準備
- すべての回で無菌テクニックを使用しています。
- ダルベッコPBS（DPBS）3.3 mLの最終容量にヒト血漿FNの株式の100μLを希釈することによってフィブロネクチン（FN）を準備します。最終濃度は30μg/ mLであり、これは1週間に4℃で保存することができます。
- FN溶液を滅菌組織培養4ウェルプレートの各ウェルの底をカバーし、15分間放置します。表面全体が覆われていることを確認してください。この時間（手順2および3）の間にメディアを作成します。
- ソリューションを、FN、プレートを乾燥することができます削除します。静かに500μLDMEM、削除DMEMでウェルを洗浄し、自己再生（SR）培地（下記参照）の500μLを追加します。 CO 2 5％を含む加湿インキュベーター中で37℃でインキュベートします。プレートは使用前に乾燥されるように解剖する前に、この約1時間を完了します。
2。 SRメディアの準備
- 迷走神経とトランクNCの培養10胚（約1リットル、マウスラインの遺伝的背景に依存します）から、SR培地の25mLを準備します。 12.5 mLの低グルコースDMEM、7.5 mLのNeurobasal中、25μLレチノイン酸（117μM最終濃度）、25μLの2 - メルカプトエタノール（50mMの最終濃度）を兼ね備えています。よ....
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ディスカッション
細心の注意は、このアプローチの成功を確実にするために胚の発達段階に支払わなければなりません。マウス初期胚の体節を数えると、ごみの中に胚を照合し、絶縁のための神経管の適切な領域を決定する段階の両方が重要です。胚の間に1つまたは2つの体節のバリエーションが行った実験の解像度に応じて、発生のタイミングの合理的な範囲内である。 9と9.5の間に胚は、DPCは17〜25体節があります。胚が25以上の体節を持っている場合は、NCはさらに発達時間が進んでいる、とNC outgrowthsは文化ではあまり堅牢となります。体節の数に基づいて、胚をステージングすると、実験の精度時の胚の発達段階を容易にするため、NC、実験の結果に影響を与えることができます。 9.5 DPCの胚では、迷走神経のNCは、定義された前後の制限の背側神経管から移行されます。半ば耳プラコードから体節7。同様に、トランクNCには、24体節にレベルの体節8時神経管から移行されます。このプロトコルで説明したようにNC前駆細胞の異なる集団を単離するために、それらのドメインのそれぞれの内のサブ領域を離散的に絶縁されています。使用される神経管の領域は、実験の設計と研究されているNCの前後の領.......
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開示事項
我々は、開示することは何もありません。
謝辞
我々は、ビデオ援助をマークウォズニアックを承認したいと思います。また、培養ラットNC細胞の元のプロトコルのためのUTの南西で、ショーン·モリソンを承認したいと思います。この作品は、ヴァンダービルト大学医療センターアカデミックプログラムのサポートを支持し、NIH（HD36720とHD036720-11S109）とPALにAHA 11GRNT7690040、NAMにAHA（0615209B）とNIH（NS065604）から博士号を取得する前の奨学金と、ERPからの補助金によってであったNIH訓練助成金T32HD007502によってサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| DMEM（低グルコース） | GIBCO / Invitrogen社 | 11885 | |
| Neurobasal中 | ギブコ | 21103 | |
| BSA | シグマ | A3912-10G | |
| DPBS | ギブコ | 14190-144 | |
| IGF1 | BDバイオサイエンス | 354037 | -20℃で50μg/ mLのアリコートでストア |
| bFGFの | BDバイオサイエンス | 354060 | -20℃で25μg/ mLのアリコートでストア |
| フィブロネクチン | ギブコ | 33016-015 | 1mg/mLらに格納されている-20℃でiquots |
| レチノイン酸 | シグマ | R2625 | -20℃でエタノールに再溶解後35μg/ mlのアリコートでストア |
| 2 - メルカプトエタノール | シグマ | D-5637 | |
| N 2の補足 | ギブコ | 17502-048 | |
| B27のサプリメント | ギブコ | 17504-044 | |
| Steriflip0.22μmのフィルター | ミリポア | SCGP00525 | |
| ペニシリン - ストレプトマイシン | インビトロジェン | 15140122 | |
| 0.20μmのフィルター | コーニング | 431219 | |
| シリンジ（ろ過用） | BDバイオサイエンス | 301604 | |
| 四ウェルプレート | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 176740 | |
| コラゲナーゼ/ディスパーゼ | ロシュ社 | 269 638 | 活動は、バッチによって異なります。 -20℃で100 mg / mLのアリコートでストア |
| インスリンの針 （29½ゲージ） | ベクトン·ディクソン | 309306 | |
| 低酸素チャンバー | ビラップス - ローゼンバーグ | ||
| 酸素分析装置 | ビラップス - ローゼンバーグ | ||
| 鉗子＃5 | ファイン科学ツール | 子宮脱落膜とを除去するために。 | |
| トリプシン-EDTA（0.25％） | ギブコ | 25200 |
参考文献
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
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再版と許可
