実験的くも膜下出血後の脳血管攣縮遅延を評価するための低死亡率のラットモデル

サマリー

動脈瘤性くも膜下出血（SAH）は時動脈瘤破裂くも膜下腔に発生する出血です。このイベントの罹患率と死亡率が改善された治療アプローチのために減少傾向にあったが、くも膜下出血後の脳血管攣縮のリスクは、それが数年前と同じであり続けている。脳血管攣縮の開始事象を識別するために、包括的かつ再現可能な動物モデルを確立することの重要性は、バリーが1979年に実験的脳血管攣縮モデルにおけるラットの最初の使用以来、研究の焦点となっているら。ラットにおける初期の研究では、大槽内に自己血の単回注射は急性につながった（数分以内）ですが、脳血管攣縮を延期しないことを実証し ^3、6、14。ここでは、再現性の遅発性脳血管攣縮の結果が低い死亡率くも膜下出血モデルラットを特徴付ける。

要約

目的：特性化開始イベント、病態生理学的変化や治療のための潜在的なターゲットを特定するために、ラットにおける動脈瘤性くも膜下出血（SAH）後の遅れの脳血管攣縮を示し、再現モデルを確立する。

方法：二十八雄Sprague-Dawleyラット（250 - 300gを） - くも膜下出血または生理食塩水対照任意に2つのグループのいずれかに割り当てられていた。 SAH群（n = 15）のラットくも膜下出血は、大槽内に、48時間離れて、自己血の二重注入によって誘発された。同様に、生理食塩水（N = 13）が大槽食塩水対照群の中に注入した。ラットは、第2の血液注射後5日目に屠殺し、脳を組織学的分析のために保存されていた。攣縮の程度は、NIHイメージ-Jのソフトウェアを使用して、内部の管腔の断面積を測定することにより、脳底動脈のセクションを使用して測定した。意義があったテューキー/クレイマーの統計分析を使用してテストされています。

結果：組織切片の分析後、脳底動脈内腔の断面積は、前者のグループの脳血管攣縮と一貫し、生理食塩水群よりもクモ膜下出血で小さかった。 SAH群、脳底動脈の内部領域（0.056μmの±3）（初期血注射後7日間）5日間第2の血液注射後血管攣縮から有意に小さかったで、内部領域と生理食塩水対照群と比較して（0.069 ±3、P = 0.004）。脳血管攣縮からの死亡は認められなかった。

結論：ラットダブルSAHモデルは、小さな動物モデルにおいて、脳血管攣縮の病態生理学的メカニズムを研究するために使用することができる穏やかな、サバイバル、脳底動脈の攣縮を誘発する。低く、許容死亡率は血管攣縮のメカニズムはelucidすることができるように理想的なSAHモデル動物に対して満足すべき重要な基準ですated ^7,8。モデルの更なる修正が血管攣縮および神経学的試験の増加重症度を調整するために行うことができます。

プロトコル

1。 0.15ミリリットル自家動脈血を注射SAH Subjectのラットの手術

1. ラットでは、ケタミン/キシラジンげっ歯類のカクテルの0.1 mg / kgを使用し、5分間静置し、麻酔をかける。
2. 十分な麻酔が後肢反射の減少によって確認された。
3. サブ後頭部周りの毛の鼻の領域に首を剃られている電子シェーバーを使用しています。
4. 動物は、手術台上に仰臥位に置かれ、尾は無菌切開を確保するためにベタジンとスワブされています。
5. ストレート1cmの正中切開を尾の腹側面に取られる
6. 尾動脈が同定され単離されるまで切開が延長されます。
7. 滅菌26ゲージのカテーテルを使用して、尾動脈にカニューレを挿入され、動脈血の0.15ミリリットルを注射器に引き込まれる。
8. 滅菌ガーゼは、切開部を封止するvetbondの適用前に、止血を確実にするために切開の周りにラップされます。
9. T彼ラットはベタジンとスワブれるサブ後頭部オーバーテーブルと剃らエリアで発生しやすいになっています。
10. 垂直正中切開·アクセスを使用すると大槽に得られる。
11. 一旦同定さ25ゲージの針を大槽内に挿入され、CSFの0.15ミリリットル、自家血液量の注入による増加頭蓋内圧力を回避するために、注射器に引き込まれる。
12. さて、尾動脈から抽出された血液の0.15ミリリットルを大槽にゆっくりと注入される。
13. 30秒は、くも膜下腔に血液凝固を確認してから、慎重に撤回するために針を付けたままにしています。
14. 止血が確保され、切開はステープルデバイスを使用して閉じられます。
15. 動物は、今や脳底動脈の周りに水槽に凍らせるために血液を許可するように20分間下の位置20°ヘッドと温暖化の面に配置されている傾向がある。
16. 1.1から1.15までの手順がバラバラに二度目の手術の48時間の間に繰り返されます。

2。 0.15ミリリットルの生理食塩水を注入しSAH題目用ラットの手術

1. ラットでは、ケタミン/キシラジンげっ歯類のカクテルの0.1 mg / kgを使用し、5分間静置し、麻酔をかける。
2. 十分な麻酔が後肢反射の減少によって確認された。
3. サブ後頭部周りの毛の鼻の領域に首を剃られている電子シェーバーを使用しています。
4. 動物は、手術台上に仰臥位に置かれ、尾は無菌切開を確保するためにベタジンとスワブされています。
5. ストレート1cmの正中切開を尾の腹側面に取られる
6. 尾動脈が同定され単離されるまで切開が延長されます。
7. 滅菌26ゲージのカテーテルを使用して、尾動脈にカニューレを挿入され、動脈血の0.15ミリリットルを注射器に引き込まれる。
8. 滅菌ガーゼは、切開部を封止するvetbondの適用前に、止血を確実にするために切開の周りにラップされます。
9. RAtは、ベタジンで描かれているサブ後頭部の上にテーブルと剃ら領域に発生しやすいになっています。
10. 垂直正中切開·アクセスを使用すると大槽に得られる。
11. 一旦同定さ25ゲージの針を大槽内に挿入され、CSFの0.15ミリリットルを注射器内に引き込まれ、サンプルが格納されます。
12. さて、通常の生理食塩水の0.15ミリリットル（37°C）を大槽にゆっくりと注入される。
13. 針は30秒間そのままにして慎重に引き抜かれる。
14. 止血が確保され、切開はステープルデバイスを使用して閉じられます。
15. 動物は、今や20分間ポジションダウン20°ヘッドと温暖化の面に配置されている傾向がある。
16. 2.1から2.15までの手順がバラバラに二度目の手術の48時間の間に繰り返されます。

3。ラットサクリファイス

1. 二度目の手術後5日目に、ラットは心臓灌流によって犠牲にされています。
2. ラットは致死量（0が与えられている致命的なプラス（VORTECHファーマ株式会社、ディアボーン、ミシガン州）の0.​​2ミリリットル/キログラム）
3. 垂直正中切開で、腹腔に接近され、腹膜が開かれます。
4. 前方開胸が行われ、心臓を露出させる。
5. リン酸緩衝液（PBS pH7.4及び37℃）に接続され、26ゲージのカテーテルを用いた動物は、血液の排出された後、4％パラホルムアルデヒドで灌流される。
6. 十分な血流を確保した後、血流が停止され、ラットを断頭台に引き渡されます。
7. 断頭後、骨骨鉗子は、脳の除去のための頭蓋を除去するために使用されます。
8. 脳と脳幹は慎重に48時間頭蓋から抽出され、4％パラホルムアルデヒド溶液に入れ、4℃で保存されています。

4。攣縮を評価するためのセクションの作成

1. 今では4日間の30％スクロースに沈めれたラットの脳は目に持って来られるセクショニングのeはクライオスタット。
2. 一度凍結保護し、12μmの切片を、被験者間の一貫性を確保するための出発点として前下小脳動脈（AICA）で、クライオスタットを使用して作成します。
3. 20セクションは上小脳動脈（SCA）で終わる、それぞれの動物のために作成されます。
4. 切片はスライドガラス上に置き、組織学的手法を用いて血管攣縮のために評価が行われ

結果

上記のプロトコルの中で、我々が以前に文献に記載されているものよりも良いモデルの特性を必要とすると考えているいくつかの手順があります。ここでは、再現性の低死亡率脳血管攣縮小動物モデルを実現し、正しく行われない場合は、このモデルに関連付けられている潜在的な落とし穴を避けるために不可欠なステップに焦点を当てる。

1。尾動脈からの自己採血：

尾動脈における血管カテーテルを慎重に配置するには、モデルに不可欠な最初のステップです。 図A-1は、ラットの尾動脈の26ゲージのカテーテルの配置を示しています。これは、最小限の外傷、出血量との良好な配置を表します。血管カテーテルの適切な配置が良い返血することによって確認することができる。

2。大槽に自己血注入：

tの深い解剖環椎後頭膜は、光沢のある白い膜（ 図A-2）として可視化されるまで、彼は後頭下部が実行されます。大槽25...

ディスカッション

げっ歯⁸よりも類似遺伝子組成と人間への解剖学的特徴を有する霊長類、より密接に遅延した脳血管攣縮のイベントを模倣し、より簡単に動脈の変更を監視する非侵襲的な画像診断装置（MRI、血管造影検査）を受けることができ、。しかし、霊長類モデルではコスト的に不可能と小動物モデルよりも複雑なケアと倫理的な問題に関連付けられています。開発されてきた小動物SAHモデルは以前にSAHを誘導する3つの方法に焦点を当てている：1）血管内動脈の血液がくも膜下腔に脱出し、負傷した動脈周囲収集することが頭蓋内動脈の穿孔、2）動脈の外科的曝露とローカル自家血栓注入;くも膜下腔への血液の⁸ 3）ダイレクトインジェクション（自家またはドナー）。すべてのモデルには、独自の長所と短所があります。例えば、血管穿孔モデル​​が最も密接aneurysのイベントを模倣mが破裂しかし外科的アプローチは、人工であり、動脈瘤くも膜下出血の典型的な人間のプレゼンテーションのイベントを模倣していないものの、非常に高い死亡率と早期血管攣縮に関連付けられています。私たちがここで説明することを直接噴射モデルは、血管穿孔モデル​​よりも低い死亡率を持っている...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
機器/試薬の名称	会社	カタログ番号
SD系雄性ラット（250〜300 g）を	タコニック	SD-M
26 Gのカテーテル	ウェブスター	8416683
25 G針	バッファロー	305122
1ccのシリンジ	中央ストア	54245
ケタミン/キシラジンカクテル	アニマルケア（SUNY）*	-
ベタジン	中央ストア	51458
スクロース	シグマ	S9378-1キロ
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148-500G
リン酸緩衝液	フィッシャー	BP-399から4
手術台	ハーバード	PY2 72から2590
OCTコンパウンド（cryoprotection）	VWR	25608-930
Superfrostスライド	フィッシャー	12-550-15

*実験動物管理学科、ニューヨーク州立大学アップステート医科大学で合成。 1 ccを追加する[100 mg / mlの] [100 mg / mlの]ケタミンの10ミリリットルにキシラジンの。