フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。
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この記事について
サマリー
要約
アテロームは、内皮機能不全をもたらす全身性炎症の高まり状態に寄与する代謝異常によって増強されています。しかし、リスクの個々のレベルを示す内皮細胞の初期段階で機能的な変更は、直接ガイド治療戦略を支援するために臨床的に評価されていません。また、地元の血行動態による炎症の調節は、アテローム性動脈硬化症の非ランダム分布に寄与しますが、機構は、 生体内で線引きするのは困難です。我々は、正確な流量条件下でのヒト内皮細胞（EC）および単球の炎症性イベントの定量的アッセイ代謝摂動のラボオンチップベースのアプローチを説明します。ソフトリソグラフィーの標準的な方法培養EC単層に直接バインドされている血管擬態流体室（VMMC）を 、microfabricateするために使用されます。1これらのデバイスは、試薬の少量をしながら使用することの利点を持っている明確に定義されたせん断場にさらされたECの膜で炎症イベントを直接イメージングするためのプラットフォームを提供しています。我々は正常ヒト大動脈EC（HAEC）におけるサイトカイン、2脂質A-3、4、RAGEによって誘導される5炎症を調査するためにこれらのデバイスを適用している。ここでは、アッセイの単球細胞（THP-1）圧延および差動のせん断特性の下でエアコンと炎症性サイトカインTNF-αによって活性化されるHAEC単層上で逮捕にVMMCの使用を文書化します。このような研究は代謝危険因子でatherosusceptibilityに機械的な洞察を提供しています。
プロトコル
1。細胞培養と基板の準備
- 旋盤を使って、100 x 20 mmの組織培養ディッシュ（BDファルコン）から3インチの円形の基板をカットします。 70％エタノールに浸漬して基板を滅菌する。室温で1時間4ミリリットルI型コラーゲン（100μg/ ml）を持つペトリ皿とコートで行われ、その後4ミリリットル1×PBSですすいでください。
- 基板に直接1ミリリットルを適用することにより、6.5x10 5細胞/ mlとシードでヒト大動脈内皮細胞（HAEC、通路4-6）を中断します。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で行われ、細胞が1時間の基質に付着することができます。
- 細胞への1xの抗生物質抗真菌剤溶液を補充した内皮増殖培地-2（EGM-2）の9ミリリットルを追加します。細胞が90％コンフルエントに達するまで2日ごとにメディアを変更します。
- 10％FBSおよび1x抗生物質抗真菌剤溶液を添加したRPMI 1640培地でTHP-1細胞を維持します。彼らは1の密度に達する通路細胞0 6細胞/ ml。
2。セルのせん断プロトコル
細胞は、カスタムコーンとプレートの細胞せん断装置（CSD）に条件付けされています。デバイスの詳細と設計仕様を表1および
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ディスカッション
我々は、CAMの発現と単球接着のリアルタイムイメージングを通じて、血管内皮の炎症性の表現型のオンチップ評価のためのマイクロ流体PDMSデバイスの使用について説明します。我々のアプローチの大きな利点は、このような動脈硬化血管内にせん断応力をミラーリング定義されている流体力学的条件の下で食事の脂質やサイトカインなどの炎症性メディエーターに曝露した細胞の内皮機能不全に関連付けられた成果を定量化する能力にあります。 VMMCは、限られた供給になると、安価でカスタマイズ可能な、高スループットの影響を受けやすいという追加の利点があるかもしれません試薬や材料の少量の使用を容易にする。
マイクロ流体デバイスの使用は、せん断に培養されたECの応答を調べるために数十年にわたって使用されているマクロスケールのアプローチに代わるものを表しています。これらは、CAであるそれぞれの平行平板フローチャンバー、円筒形のチューブ、コーン及びプレート粘度計を含む着実に、層流ポアズイユ流条件（16日）堂々のpable。これらのデバイスへの変更の壁せん断応力の時間的または空間的な変化を生み出す、ある.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
この作品は、スコット·I.サイモン、アンソニー·G. PasseriniにNIH / NHLBIの助成金R01 HL082689によってサポートされていました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アイテム | 会社 | カタログ番号 | |
| 100×20ミリメートルのペトリ皿 | BDファルコン | 353003 | |
| エタノール95パーセント | EMDケミカルズ | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21から031-CV | |
| 私はラット尾由来のコラーゲンを入力します。 | ギブコ | A10483-01 | |
| ヒト大動脈内皮細胞 | Genlantis | PH30405A | |
| 抗生物質抗真菌ソリューション | インビトロジェン | 15240-062 | |
| 内皮BulletKit | ロンザ | CC-4176 | |
| 内皮細胞基本培地-2 | ロンザ | CC-3156 | |
| 10mlのシリンジ | BDファルコン | 309604 | |
| ポリウレタンチューブ | タイゴン | ABW0001 | |
| リーボビッツ-15メディア | ギブコ | 11415-069 | |
| Sylgard 184シリコーンエラストマーベース | ダウコーニング | 184 | |
| Sylgard 184シリコーンエラストマー硬化剤 | ダウコーニング | 184 | |
| SU8フォトレジストマスターウェーハ | カリフォルニア大学デービス校パンラボ | N / A | |
| EclipseのTE200倒立顕微鏡 | ニコン | EclipseのTE200 | |
| 注射器ポンプ | ハーバード装置 | PHD2000 | |
| 19ゲージの注射針 | ケンドール | 8881 | |
| THP-1単球細胞系 | ATCC | TIB-202 | |
| のCa 2 + / Mgの2 HBSS（ハンクス緩衝化生理食塩水溶液）+ | ギブコ | 14025-092 | |
| 腫瘍壊死因子α（TNF-α） | R＆Dシステムズ | 210-TA-010 | |
| 間質由来因子 - 1（SDF-1） | R＆Dシステムズ | 350 NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10から040-CV | |
| ヒト血清アルブミン（HSA） | ZLBベーリング | NDC 0053-7680-32 |
表2特異的試薬および装置。
参考文献
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I.
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再版と許可
