オンチップ·血管内皮の炎症性表現型

サマリー

フォトリソグラフィ法によりエッチングし、PDMSから製造されるマイクロ流体フローチャンバーは、EC機能不全や炎症に関連付けられた機能的転帰を調べるために適用されます。代表的な実験では、EC単層を活性化サイトカインの単球の細胞接着を調節する差動せん断応力の能力が実証されています。

要約

アテロームは、内皮機能不全をもたらす全身性炎症の高まり状態に寄与する代謝異常によって増強されています。しかし、リスクの個々のレベルを示す内皮細胞の初期段階で機能的な変更は、直接ガイド治療戦略を支援するために臨床的に評価されていません。また、地元の血行動態による炎症の調節は、アテローム性動脈硬化症の非ランダム分布に寄与しますが、機構は、 生体内で線引きするのは困難です。我々は、正確な流量条件下でのヒト内皮細胞（EC）および単球の炎症性イベントの定量的アッセイ代謝摂動のラボオンチップベースのアプローチを説明します。ソフトリソグラフィーの標準的な方法培養EC単層に直接バインドされている血管擬態流体室（VMMC）を 、microfabricateするために使用されます^。1これらのデバイスは、試薬の少量をしながら使用することの利点を持っている明確に定義されたせん断場にさらされたECの膜で炎症イベントを直接イメージングするためのプラットフォームを提供しています。我々は正常ヒト大動脈EC（HAEC）におけるサイトカイン^、2脂質^{A-3、4、RAGE}によって誘導される⁵炎症を調査するためにこれらのデバイスを適用している。ここでは、アッセイの単球細胞（THP-1）圧延および差動のせん断特性の下でエアコンと炎症性サイトカインTNF-αによって活性化されるHAEC単層上で逮捕にVMMCの使用を文書化します。このような研究は代謝危険因子でatherosusceptibilityに機械的な洞察を提供しています。

プロトコル

1。細胞培養と基板の準備

1. 旋盤を使って、100 x 20 mmの組織培養ディッシュ（BDファルコン）から3インチの円形の基板をカットします。 70％エタノールに浸漬して基板を滅菌する。室温で1時間4ミリリットルI型コラーゲン（100μg/ ml）を持つペトリ皿とコートで行われ、その後4ミリリットル1×PBSですすいでください。
2. 基板に直接1ミリリットルを適用することにより、6.5x10 ⁵細胞/ mlとシードでヒト大動脈内皮細胞（HAEC、通路4-6）を中断します。 37℃、5％CO ₂インキュベーター内で行われ、細胞が1時間の基質に付着することができます。
3. 細胞への1xの抗生物質抗真菌剤溶液を補充した内皮増殖培地-2（EGM-2）の9ミリリットルを追加します。細胞が90％コンフルエントに達するまで2日ごとにメディアを変更します。
4. 10％FBSおよび1x抗生物質抗真菌剤溶液を添加したRPMI 1640培地でTHP-1細胞を維持します。彼らは1の密度に達する通路細胞0 ⁶細胞/ ml。

2。セルのせん断プロトコル

細胞は、カスタムコーンとプレートの細胞せん断装置（CSD）に条件付けされています。デバイスの詳細と設計仕様を表1および図4に記載されています。

1. CSDを準備します。エタノールでチャンバハウジングを殺菌し、滅菌PBSですすいでください。コー​​ンは、細胞単層に垂直であることを保証するために37°Cおよびレベルへの熱住宅を。ハウジングの底部から細胞を基板を組み立て、目的の高さにコーンを設定します。
2. リーボビッツ-15（L-15）CO ₂の存在下で適切なpHを維持するために、せん断媒体として内皮BulletKitを添加した培地を使用しています。炎症を刺激する剪断媒体に腫瘍壊死因子-α（TNF-α、は0.5 ng / ml）を加え、入口ポートに接続されたシリンジを介してデバイスに6ミリリットルを注入し、空気を導入しないように世話をするチャンバー内の気泡。
3. 4時間の高振幅安定したせん断応力（HSS、15ダイン/ cm ^2）または振動せん断応力（OSS、0±5ダイン/ cm ^2、1 Hz）でのせん断細胞。希望するSSは正確に前述のようにマイクロステッピングモータで制御された細胞は、上記円錐を回転させることにより達成され⁶面の壁_SS（τW）で近似されます。
   
   μは媒体の粘度であり、ωはコーンの角速度であり、αはコーン角（0.5°）である。基板とコーンのアライメントは、精度の平準化と20に設定し、ギャップの高さを介して_0.05°±τwの円周方向と半径方向の変動を最小限に抑えるために深さゲージを使用して、10μmの範囲内に調整されます。デバイスは、層流の特性を確保するために検証されています。 cを削除するデバイスからellsと単球接着の分析のために準備します。

3。 PDMSマイクロ流体チャンバーの作製

1. アプリケーションに応じて、目的のマイクロチャンネル番号とチャンネルの高さのマスター型を取得します。このプロトコルで使用されている特定の設計の特性を表1に詳述されています。 これらを作成するための方法はすでによく文献に記載されています^。1簡単に言えば、チャンネルのネットワークは、CADソフトウェアを使用して設計された（Autodesk Inventorの）と5000 dpiで印刷されます透明性。ネガ型フォトレジスト（SU8）は、100μmの厚さのシリコンウエハ上にスピンされています。透明度は重ねて、紫外線にさらされています。非重合フォトレジストが正のレプリカマスターを生成するために削除されます。
2. 計量ボートの重量によるシリコーン硬化剤10：01とPDMS液混合シリコーンベースを作成し、5ミリリットル血清をピペットで攪拌する。壁をこすりしないように注意してくださいのソリューションにプラスチックのフレークを加えないようにするためにボートの重量を量る。
3. 100x15mmのペトリ皿の中でマスターウェハを配置し、皿にPDMS液を注ぐ。
4. 皿をカバーし、気泡を除去するために15分間、真空容器内に配置します。 15分後にペトリ皿を取り出し、軽く表面上に空気を吹き込むことによって余分な気泡を除去します。
5. 70℃で1時間オーブンでペトリ皿を置き℃に皿を取り外し、鋭い刃を使用して流体チャンバを切り取る。

4。顕微鏡上のデバイスの組立

1. 倒立顕微鏡に光源をオンにして、37にヒーター℃に設定してください。 10mlのシリンジにチューブを接続し、気泡が存在しないことを、蒸留水でいっぱいに。シリンジポンプにシリンジを置き、1ダイン/ cm ²の壁SSを誘導するために流量を設定します。チャネルの中心線に沿って生成された壁面せん断応力_（τw）の標準を使用して近似されます。平行平板フローチャンバーの式：
   
   μは体積流量Qは媒体の粘度であり、hはチャネルの高さ、Wはチャネル幅です。 注：チャネルは有限の幅があるので、実際の_τwは wはチャネルに応じて異なりますアスペクト比、および測定は、側壁に最も近い25％で回避されます^。1,7
2. 水の中にPDMSチャンバーを配置し、個々のチャネルから空気を除去するために100μlのマイクロピペットを使用しています。バルブがオフに設定されていることを確認してチャンバーに真空アダプターを取り付けます。
3. 目標以上HAEC単分子膜でペトリ皿を置きます。ペトリ皿の上にPDMSチャンバーを配置しない気泡がデバイスと単層の間に形成されないことを保証しながら慎重にHAEC単分子層の上に置きます。真空がオンになっているとチャンバーがしっかりと接続されているように、バルブを回します。
金属左の唯一の5ミリメートルがあるよう鈍ら19ゲージの針をカットします。バッファを使用してプラスチック製のタンクを記入し、PDMSチャンバーの入り口に入れられます。使用するチャネルの適切な数に対して、この手順を繰り返します。シリンジポンプからPDMSチャネル出口にチューブを取り付けます。

5。せん断応力下では単球接着アッセイ

1. HBSS +のCa ^{2 +} / Mg ^{2 +の} + 0.1％HSAに2×10 ⁶細胞/ mlのTHP-1細胞をサスペンドします。室温で15分間、間質由来因子-1（SDF-1、濃度50μg/ ml）でインキュベートすることによりアクティブ化THP-1細胞。
2. フローを確立するため、シリンジポンプの電源を入れ、気泡を導入することなく、貯水池の細胞懸濁液50μlを加える。一度流れが完全に開発され、データ収集を開始します。
3. 解決策が少なくなった場合は、貯水池にバッファを追加し、適切な流量で5分間実行されます。フロー·ストリーム内の任意の未結合細胞を洗浄するためのチャンネルにバッファを流れる続けています。

6。データ収集と分析

1. チャンネル内の3箇所でのチャネルの縦軸に沿って完全に開発の流れは、次の2分間3フレーム/秒でデジタル画像のシーケンスを取得し、入学後、または最寄りの出口側ポートまたは25％の直前に記録しないように注意しながら壁。
2. 単分子層と同じ焦点面での位相明るい外観を識別することによってフィールドごとに停止した細胞の数を数えます。
3. しっかりとした細胞の逮捕は、10秒の動き<½セルの直径によって定義されています。 3ランダムフィールド/チャネルを介して平均データと、ImageJソフトウェアを使用して定量化する。

7。代表的な結果

血管内皮が均一に全身性炎症に寄与するアゴニストにさらされていますが、アテローム性動脈硬化症は、内皮機能の空間的な異質性をが関与し、動脈内の流れの乱れのサイトで優先的に開発の焦点疾患である^8。 。9、10、TNF-αの細胞接着分子（CAMのアップレギュレーションを含むECで十分に特徴付けられた応答を誘導する;例えば、VCAM-1、ICAM-1、E-セレクチン）およびケモカイン循環から募集球、早期のアテローム性動脈硬化病変の特徴で^、11動態内皮細胞の炎症性表現型の重要な調節因子である¹²高の大きさのせん断応力（HSS。例えば15ダイン/ cm ^2）または拍動性のせん断応力（PSS、動脈のアテローム性動脈硬化症への抵抗のサイトに関連付けられている例えば15±5ダイン/ cm ^{2）は、TNF-α}誘導応答をダウンレギュレートする。逆に、低振幅のせん断応力（LSS、例えば、2ダイン/ cm ^2）または振動せん断（OSS;例えば0±5ダイン/ cm ^2）in vivoでの影響を受けやすい部位の特徴、cytokiを悪化させるNE-誘発性炎症^13、14私たちのマイクロ流体PDMSデバイスは、内皮機能と病態の調節における流体力学的因子と代謝ストレスの重ね合わせに関連した仮説を検証する機構の研究を実施するためのプラットフォームを提供します。アプローチの有用性と汎用性は、大きく分けて以下の代表的な結果により示されています。

図1。せん断応力は、差動TNF-α炎症性内皮単層にTHP-1細胞接着を調節する。これらのデータは、上記の、ビデオに記載されて説明した詳細なプロトコルを使用して取得した。 HAEC単層は、同時に炎症性サイトカインTNF-α（0.5 ng / mlと、VCAM-1のアップレギュレーションのために〜EC _50）およびHSS（15ダイン/ cm ^2）やOSS（0±5ダインのいずれかの低用量に暴露されたdescriとして4時間のカスタムCSDで/ cm ^2で 、1 Hz）を詳細なプロトコルのベッド。 THP-1細胞の逮捕は、PDMS流チャンバ内のせん断流の下で定量した。ヒト単球の表現型を模倣し、この細胞株は、その再現性と使いやすさのために選ばれました。 HSS減衰炎症反応は低下したTHP-1細胞停止の結果、OSSに比べて。データは、スチューデントのt検定により分析し、平均値±3つの独立した実験のSEMとして表されます。DeVerseらから許可を得て適応^5。

以下のデータは私たちの公開作品から例を使用して、我々のアプローチの多様性を示しています。該当する場合、上記のプロトコルからの逸脱が示されている。

図2。せん断応力勾配におけるサイトカイン誘導VCAM-1発現と単球の動員の変調。 A）HAEC単層floの下で4時間TNF-α（0.3 ng / ml）で刺激したHele-Shawのフロー理論に基づいて設計さVMMCのワット¹⁵チャンネルの中心線に沿ってSSの大きさの線形減少は、二次元よどみ流れの合理化と終了を形成すると一致するようにチャンバの側壁を設計することによって達成されたチャンネルのISO-電位線を一致させることができます。入り口から軸方向距離（x）の時にこのチャネルの中心線に沿って生成された壁面せん断応力_（τw）は次式で与えられます。

μは体積流量Qは媒体の粘度、ここで、hはチャネルの高さであり、w _1は、チャネルの入り口の幅、Lは総チャネルの長さです。Q 16 ​​からSSの大きさの勾配を生成するために選ばれましたよどみ点における0〜入口ダイン/ cm ² outleに""ちょうど近トン。B）-C）VCAM-1発現は、量子ドットに結合して刺激静的コントロールの割合の中央値の蛍光強度（MFI）として提示抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡でその場で測定した。 SSは刺激HAEC（灰色の三角形）が低く、VCAM-1の基底レベルを調節していませんでした。しかし、VCAM-1発現は、〜2ダイン/ cm ²でピークとせん断の大きさ> 5ダイン/ cm ^2（黒四角）で、以下のTNF-αのベースラインに戻ったり、LSSの大きさで、TNF-αの相対増加した。D）単球（10 ⁶ / ml）を）のように前提条件と組織化単分子膜上のパラレル·フロー· ​​チャンネルで5分間2ダイン/ cm ²で灌流した。内皮への単球の動員を定量的に与えられたせん断応力の大きさで、VCAM-1発現と相関していた。特に、monolayeの細かい空間分解能とVCAM-1発現と単球の動員を調べる機能rは、独立した実験でせん断わずか数離散値を適用することによって理解されないSSの大きさの狭い範囲で大きな変化を明らかにした。データは、TNF-αから* P <0.05静的な条件下では、反復測定ANOVAとニューマン·クールズ事後テストによって評価の違いによって分析した。データは平均±3から6の独立した実験からのSEM。 族らから許可を得て適応^2。

図3。トリグリセリドに富んだリポ蛋白（TGRL）はドナー血清トリグリセリドレベルとVCAM-1発現に比例してサイトカイン誘導炎症を調節する。HAECの単層をTGRL（10 mg / dlと同時に4時間TNF-α（0.3 ng / ml）で刺激したアポ）静置培養における高脂肪の食事の後に被験者から単離された）。VCAM-1発現はフローサイトメトリーによって中断されたECで個別に測定した。と単球の接着には、詳細なプロトコルで説明されているようVM​​MCを用いて定量。データは、TNF-αからの％変化として表示されます。単球の逮捕は、ドナー血清トリグリセリドのレベルを直接に増加した。B）炎症誘発性ドナーのサブセットの単球停止がVCAM-1のブロッキング抗体の存在下で抑制された内皮細胞VCAM-1発現に直接比例して変化した。意義が対スチューデントt検定によって決定され、3-5の独立した実験からの平均±SEMを意味します。Wangらの許可を得て適応^4。

ディスカッション

我々は、CAMの発現と単球接着のリアルタイムイメージングを通じて、血管内皮の炎症性の表現型のオンチップ評価のためのマイクロ流体PDMSデバイスの使用について説明します。我々のアプローチの大きな利点は、このような動脈硬化血管内にせん断応力をミラーリング定義されている流体力学的条件の下で食事の脂質やサイトカインなどの炎症性メディエーターに曝露した細胞の内皮機能不全に関連付けられた成果を定量化する能力にあります。 VMMCは、限られた供給になると、安価でカスタマイズ可能な、高スループットの影響を受けやすいという追加の利点があるかもしれません試薬や材料の少量の使用を容易にする。

マイクロ流体デバイスの使用は、せん断に培養されたECの応答を調べるために数十年にわたって使用されているマクロスケールのアプローチに代わるものを表しています。これらは、CAであるそれぞれの平行平板フローチャンバー、円筒形のチューブ、コーン及びプレート粘度計を含む着実に、層流ポアズイユ流条件^（16日）堂々のpable。これらのデバイスへの変更の壁せん断応力の時間的または空間的な変化を生み出す、ある...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アイテム	会社	カタログ番号
100×20ミリメートルのペトリ皿	BDファルコン	353003
エタノール95パーセント	EMDケミカルズ	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21から031-CV
私はラット尾由来のコラーゲンを入力します。	ギブコ	A10483-01
ヒト大動脈内皮細胞	Genlantis	PH30405A
抗生物質抗真菌ソリューション	インビトロジェン	15240-062
内皮BulletKit	ロンザ	CC-4176
内皮細胞基本培地-2	ロンザ	CC-3156
10mlのシリンジ	BDファルコン	309604
ポリウレタンチューブ	タイゴン	ABW0001
リーボビッツ-15メディア	ギブコ	11415-069
Sylgard 184シリコーンエラストマーベース	ダウコーニング	184
Sylgard 184シリコーンエラストマー硬化剤	ダウコーニング	184
SU8フォトレジストマスターウェーハ	カリフォルニア大学デ​​ービス校パンラボ	N / A
EclipseのTE200倒立顕微鏡	ニコン	EclipseのTE200
注射器ポンプ	ハーバード装置	PHD2000
19ゲージの注射針	ケンドール	8881
THP-1単球細胞系	ATCC	TIB-202
のCa 2 + / Mgの2 HBSS（ハンクス緩衝化生理食塩水溶液）+	ギブコ	14025-092
腫瘍壊死因子α（TNF-α）	R＆Dシステムズ	210-TA-010
間質由来因子 - 1（SDF-1）	R＆Dシステムズ	350 NS-010
RPMI 1640	Cellgro	10から040-CV
ヒト血清アルブミン（HSA）	ZLBベーリング	NDC 0053-7680-32