方法論記事

水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

DOI：

10.3791/4182

⸱

2012年10月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

油汚染の浄化のための持続可能な自動調整システムは、標準的な細菌DNAの交換部品（BioBricks）を使用して設計されました。エンジニアリング E大腸菌の株が有毒、水性環境中のβ-酸化を介しアルカンを分解するために使用されていました。異なる種からそれぞれの酵素は、アルカン分解活性を示した。また、に耐性の増加 N-ヘキサンをアルカントレラント細菌由来の遺伝子を導入することによって達成された。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品は、前方の大腸菌によるアルカンの変換を可能にし、その適用性の原理の証明を提示するツールキットを置きます。このツールキットには、複数の標準交換部品（BioBricks）9アルカンの変換、有毒な炭化水素に富む環境における遺伝子発現と生存の調節をアドレッシングで構成されています。

アルカン分解の3段階経路を大腸菌で実装されました大腸菌それぞれアルカノール、カナール、最終的にアルカン-アミノ酸に、中長期鎖アルカンの変換を有効にする。後者はネイティブのβ-酸化経路を介して代謝された。中鎖アルカン（C5〜C13）とシクロアルカン（C5〜C8）、Gordonia spからアルカンヒドロキシラーゼシステムの4つの遺伝子（alkB2、rubA3、rubA4とrubB）の酸化を促進する。 TF6 8,21を 大腸菌に形質転換した大腸菌 。の変換のための長鎖アルカン（C15-C36）は、Geobacillus thermodenitrificansからLADA遺伝子が実装されました。分解プロセスの必要なさらなる手順については、ADHとALDHは（G. thermodenitrificans由来する）10,11を導入しました。活動は休止細胞アッセイにより測定した。各酸化ステップでは、酵素活性が観察された。

プロセス効率を最適化するために、式は唯一、低グルコース条件下で誘導されました：基板-調節プロモーター、pCaiF、使用されていました。 pCaiFは大腸菌に存在している大腸菌 K12と非グルコース炭素源の分解に関与する遺伝子の発現を調節する。

ツールキットの最後の部分-生存を標的に- PhPFDαとβ溶媒耐性遺伝子、 パイロコッカスホリコシ OT3からの両方を使用して実装されていました。有機溶媒としては、否定的にaffectinによって細胞ストレスを誘導し、生存性を低下させる可能性がGタンパク質の折り畳み。シャペロンとして、PhPFDαβはアルカンの存在下でタンパク質の折りたたみのプロセスなどを改善します 。培地で10％n-ヘキサンのプレゼンスの増加成長率（最大50％）で示される炭化水素の改善·トレランスにつながったこれらの遺伝子の発現が観察された。

要約すると、結果は、ツールキットは大腸菌を可能にすることを示す大腸菌水性環境中の炭化水素に変換して耐える。このように、それは合成生物学のアプローチを用いてオイル浄化のための持続的な解決に向けた第一歩を表しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

油汚染は、環境汚染の最も深刻な原因の一つであり、生態系、ビジネス、コミュニティに大きな影響を与えます3。たとえば、カナダのアルバータ州のオイルサンド尾鉱水域から発生する継続的な油汚染と戦うためには、解決策が必要です。オイルサンドからの石油抽出の過程で、半固体の酸化型であるビチューメンは、石油1バレルあたり約3.1バレルの水を消費する熱回収技術を使用して除去されます1。主に地元の川から供給される油で汚染されたプロセス水は、ビチューメン抽出後に尾鉱池に貯留されます。淡水の取水の必要性を減らすために、プロセス水のより効果的なリサイクルが必要です。ビチューメンの抽出を容易にし、下流のサイトが水生生態系の保護のための水質ガイドラインを満たすようにするために、プロセス水処理は急速に進化しています3。

有機化合物の汚染を処理するために、微生物を利用したバイオレメディエーション技術が現在奨励されています1。アルカンは、原油中に最も豊富に存在する炭化水素ファミリーであり、分子あたり5〜40個の炭素原子を含んでいます7、21。多くの細菌は、末端のメチル基の連続的な酸化を通じてさまざまな長さのアルカンを分解し、最初にアルコール、次にアルデヒド、最後に脂肪酸を形成することが知られています8。このiGEMプロジェクトでは、さまざまな生物由来のいくつかの酵素が発現および特性....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1。 BioBrickアセンブリ

  1. 標準生物学的部分のレジストリからBioBricksはIGEM本部によって提供されています。既存BioBricksから新しいBioBrickを構築するために、アクセプター部分のドナー部分の下流に位置決めするための酵素EcoRIとSpeIでドナーBioBrick（最大1.0μg）を消化。アクセプター部の上流ドナー部分を位置決めするためのXbaIとPstIでダイジェスト。ドナーのバックボーンにカット第三適切な制限酵素を追加します。サプライヤー（最終濃度1X）によると、適切な緩衝液20〜25 mlの総体積で消化を行う。制限酵素のた​​めの5単位/μgのDNAを使用しています。
  2. EcoRIおよびXbaIまたはSpeIとPstIでどちらかとアクセプタBioBrickを消化。
  3. 37℃で1時間（少なくとも）のために消化をインキュベート℃に制限エンドヌクレアーゼは、熱によって不活性化、80℃インキュベーションまもなく10分間遠心℃で。
  4. 消化BioBrickを連結一緒にパーツ（ドナーとアクセプター）。 XbaIとSpeIでは、互換性のDNA末端を生成するので、混合型のサイトは、4つの標準的な制限部位に隣接、新しい "複合" BioBrickに起因するいかなる制限酵素で切断することはできませんが作成されます。ライゲーション混合物で最終DNA濃度は、好ましくは約100 ng /μlに。 T4のライゲーションバッファー（最終濃度1x）とT4リガー....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アルカン変換

アルカンからそれぞれの脂肪酸への3つの酸化ステップの活性は、休止細胞アッセイと酵素活性測定を使用して評価されました。結果は、(1)アルカンヒドロキシラーゼ、(2)アルコールデヒドロゲナーゼ、および(3)アルデヒドデヒドロゲナーゼの経路反応に従って提示されます
最初のステップでは、中鎖アルカンと長鎖アルカンに対して異なるプラスミドを構築しました。プラスミドBBa_K398014には、中鎖アルカン酸化のためのアルカンヒドロキシラーゼ(AH)系の4つの遺伝子が含まれています:alkB2、rubA3、rubA4、および単一の構成プロモーター(BBa_J23100)の制御下にあります。ネガティブコントロールとして、プラスミ.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioBrick原理は、アルカンの分解のために、シャーシを構築するために使われ、このツールキットの単一コンポーネントの原理の証明を得た。いくつかのアッセイは、in vivoおよびアルカン分解する経路酵素のin vitro活性を測定するために提案されている。提示された仕事は、正常宿主生物大腸菌の酵素活性と発現を決定するために使用できるメソッドの数を示しています適当BioBricksの実施後大腸菌 。さらに、それはBioBrick原理はアルカンの分解に必要なタンパク質を発現する生物を設計するために使用できることが示されている、唯一の必要なこれらの酵素を生産し、炭化水素の存在下で宿主生物の耐性を増強する規制システムを提供しています。一度さらに発展、このシャーシは、残油、水を尾行オイルサンドにおける例 、または治療のための生物学的分解を使用することができる石油産業からの排水。

アルカン劣化に関しては、アッセイは、アルカン分解（AH-システムとLADA）の最初のステップに関与する酵素のキャラクタリゼー.......

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このビデオの記事で行った実験国際遺伝子改変マシン競争9のために開発されました。著者はIGEMのチームメンバーにルークBergwerff、ピーテルTMバンBoheemen、Jelmerクノッセン、ヒューゴ·F Cuetoロハスとするためラモンファンデルファルクに感謝したいと思います研究の援助。我々は有用な議論ハン·デ·Winde、ステファンデコックとEsengülYILDIRIMに感謝し、この研究をホスティング。この作品は、バイオテクノロジーのデルフト工科大学部、デルフトインフォマティクス研究室、Bionanoscienceのデルフト工科大学学科、オイルサンドリーダーシップイニシアティブ（OSLI）、スタッドstudentenuitzendbureau、オランダゲノミクスイニシアティブ、Kluyverセンター、Nederlandse Vereniging Biotechnologische（開発元：Stichtingバイオオランダ）によってサポートされていました、DSM、GENEART、グライナーバイオ1とジェネンコア。

....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OctaneFluka74822
HexadecaneFluka52209
octanol-1Fluka95446
dodecanol-1Sigma-Aldrich126799
HexaneSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligaseNew England BiolabsM0202L
ガスクロマトグラフ
細胞攪乱器LABiosystemsCD-019
分光光度計Amersham pharmaciaspec 2000
プレートリーダーTecan Group Ltd.Magellan v7.0
インキュベーターInnova、44
BioBrickTM K398014:BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4-BBa_J61100-rubBデルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品のレジストリBBa_K398014アルカンヒドロキシラーゼSystem
耐性:クロラムフェニコール
BioBrickTM K398027:BBa_R0040-BBa_B0034-ladAデルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品の登録BBa_K398027ladA Protein Generator
耐性: Chloramphenicol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH デルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品の登録BBa_K398018ADH generator
耐性: Chloramphenicol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH デルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品の登録BBa_K398030>ALDH generator
耐性: Chloramphenicol
BioBrickTM K398326: pCaiF デルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品の登録BBa_K398326pCaiF promoter
耐性: Chloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401デルフト工科大学のバイオテクノロジー学部または標準生物部品登録BBa_K398331pCaiF測定器
抵抗性:クロラムフェニコール
BioBrickTM K398406:BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- デルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的部品の登録BBa_K398406溶剤耐性クラスター
耐性: クロラムフェニコール

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological C....

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Escherichia coliBioBricks

関連記事