心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。
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この記事について
サマリー
要約
ほとんどの戦略は、唯一の細胞マーカータンパク質1に依存しているとして、心筋細胞の核の同定は、組織切片に挑戦されています。そのような増殖およびアポトーシスとして心筋細胞では稀なイベントは、心筋細胞核の正確な同定は、恒常性と病理学的状態2の細胞の更新を分析する必要があります。ここでは、中心体周辺物質1（PCM-1）およびそれ以降のフローサイトメトリー選別に対する抗体を用いた密度の堆積作用と免疫標識によって死後組織から心筋細胞核を単離する方法を提供します。この戦略は、新鮮な組織と凍結アーカイブ材料にも同様の作業の利点を有するハイスループット解析と分離することができます。これにより、既にバイオバンクで収集された材料を研究することができます。この手法は適用可能で、種の広い範囲でテストし、そのような炭素14年代測定3、セル-CYなどの複数のダウンストリームアプリケーションに適していますCLE分析4、チミジン類似体の可視化（例えば、BrdUとIDU）4、トランスクリプトームとエピジェネティクス解析。
プロトコル
1。心臓核の単離
- 1％BSA / PBSコーティング溶液10mlとコート遠心管（Beckmanの遠心チューブ＃363664）。チューブにフタをし、それらがチューブローテーターで30分間回転させましょう。コーティング溶液を除去し、遠心チューブの空気乾燥した（マウスの心臓ごとに管が異なる種からの単一のマウスの心臓、交互に最大5つのマウスの心臓や心臓の組織の1グラムの分析のために必要とされるみましょう（例えば、ヒト）処理することができます1チューブで）。
- すべての次の手順は氷の上で実行する必要があります。メスで新鮮な、またはスナップインを凍結したマウスの心臓から左心室を解剖。 （注）このプロトコルは、マウスの心臓のために最適化されていますが、また、ラットやヒトの心臓に適合させることができます。また、異なる種から心臓組織の1グラムまで使用しています。
- メスの小さな個室に試料をトリミングします。
- 溶解緩衝液15ミリリットルを充填した50mlファルコンチューブに組織片を転送します。
- ホモジナイズ10秒24,000 rpmでT-25ウルトラタラックスプローブホモジナイザー（IKA）の心臓組織。
- 30ミリリットルに溶解用緩衝液と等量のホモジネートを希釈する。
- さらに組織と自由核を均一にガラスdouncer（40ミリリットル）を使用します。大クリアランス乳棒で8打を実行します。
- 連続して、100μ....
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ディスカッション
心筋細胞核の正確な識別は、心筋2,3の再生過程の分析のために重要である。新鮮な組織から心筋細胞を分離する従来の手法は、主に細胞外マトリックスタンパク質の酵素消化と低速遠心分離により間質細胞からの後続の精製に基づいています。胚性幹細胞（ESC）から生きている心筋細胞のさらなる精製は、そのようなSIRPA 9またはミトコンドリアの染料10などの表面マーカーで免疫標識により行うことができ、固定の心筋細胞は、そのようなミオシン重鎖（MHC）あるいは次のような核タンパク質として細胞質のマーカーにより識別することができますGATA4またはNkx2.5。しかし、Nkx2.5とGATA4の発現は、成熟した心筋細胞に限定されず、また、開発中および心筋梗塞後の11,12前駆細胞で検出することができます。心筋細胞を識別するための遺伝的戦略は、最高の特異性が、Cを示してannotは、大規模な動物モデルやヒト1で適用されます。既存戦略の限界は、増殖、アポトーシスおよびキメラ1,13としてまれな事象の定量化に頼る論争の結論につながって.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
我々は、フローサイトメトリーの支援についてはマルセロ·トロに感謝したい。本研究では、スウェーデンのハートと肺財団、欧州委員会FP7 "CardioCell"、スウェーデンの研究評議会、AFA保険やALFによってサポートされていました。 OBは、ドイツ学術振興によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1。溶解バッファー | |||
| 試薬の名前 | |||
| 0.32Mスクロース | |||
| 10mMトリス-HCl液（pH = 8） | |||
| 5mMのCaCl 2を | |||
| 5mMの酢酸マグネシウム | |||
| 2.0mMのEDTA | |||
| 0.5mMのEGTA | |||
| 1mMのDTT |
| 2。ショ糖バッファ |
|---|
| 試薬の名前 |
| 2.1 Mのショ糖 |
| 10mMトリス-HCl液（pH = 8） |
| 5mMの酢酸マグネシウム |
| 1mMのDTT |
| 3。核貯蔵緩衝液（NSBプラス） |
|---|
| 試薬の名前 |
| 0.44 Mショ糖 |
| 10mMトリス-HCl液（pH = 7.2） |
| 70mMのKClを |
| 10mMのMgCl 2 |
| 1.5 mMのスペルミン |
| 試薬および器具 | 会社 |
|---|---|
| アイソタイプウサギIgG-ChIP用グレード、＃ab37415 | アブカム |
| ウサギ抗-PCM-1抗体、＃HPA023374 | アトラス抗体 |
| ロバ秒。抗体、抗ウサギアレクサ488弗素、＃-21206または同等秒。蛍光抗体 | ライフテクノロジーズ |
| DRAQ5 | Biostatus |
| セルストレーナーは30μm、70μmと100μm | BDバイオサイエンス |
| ガラスdouncer（40ml）および"L"を乳棒 | VWR（ウィートン工業株式会社） |
| T-25ウルトラタラックスホモジナイザー | IKAドイツ |
| 分散ツールS25 N-18 G | IKAドイツ |
| ベックマン·アヴァンティ遠心 | ベックマン·コールター |
| ファルコンチューブ15ミリリットルと50ミリリットル | VWR |
| ベックマン遠心チューブ＃363664 | ベックマン·コールター |
| JS13.1フリースイングローター | ベックマン·コールター |
| 流入メーター | ベックマン·コールター |
| チューブローテーター | VWR |
参考文献
- Ang, K. L. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).
- Bergmann, O.
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再版と許可
